由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法技术

本发明专利技术提供了一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，该方法主要包括以下步骤：(1)将植物双元载体改造成含有prtA表达盒的双元表达载体，含有GPDA启动子和GPF报告基因；(2)双元载体转化农杆菌AGL1；(3)在DPY培养基培养野生型米曲霉3.042，3天后洗下孢子；(4)孢子与含有目的载体的农杆菌共培养48小时；(5)共培养后的孢子转移到含有头孢和吡啶硫胺素的CD培养基筛选；(6)筛选培养基生长出来的转化子进一步验证。本发明专利技术首次建立了农杆菌介导的以吡啶硫胺素为筛选标记的转基因体系，较原来的原生质体介导的转基因体系减少工作量，提高了转化效率，为米曲霉遗传操作奠定了基础。

Construction of transgenic system of Aspergillus oryzae mediated by Agrobacterium tumefaciens mediated by pyridine thiamine

The invention provides a method for constructing an Agrobacterium-mediated Aspergillus oryzae transgenic system with pyridinium thiamine as a screening marker. The method mainly comprises the following steps: (1) transforming a plant binary vector into a binary expression vector containing a prtA expression box containing a GPDA promoter and a GPF reporter gene; (2) transforming a binary vector into an Agrobacterium oryzae. AGL1; (3) Spores of Aspergillus oryzae were washed after 3 days in DPY medium; (4) Spores were co-cultured with Agrobacterium containing the target vector for 48 hours; (5) Spores were transferred to CD medium containing cephalosporin and pyridinium thiamine for screening; (6) Converters grown on the screening medium were further verified. The Agrobacterium-mediated transgene system with pyridinium thiamine as the screening marker is established for the first time, which reduces the workload and improves the transformation efficiency compared with the original protoplast-mediated transgene system, and lays a foundation for the genetic operation of Aspergillus oryzae.

【技术实现步骤摘要】
由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法
本专利技术涉及分子生物学
，进一步涉及米曲霉转基因体系构建技术，具体涉及一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法。
技术介绍
米曲霉作为食品安全级的真菌不仅在传统食品发酵、调味品和酿造等行业中具有十分悠久的应用历史，而且在诸如酶制剂、重组蛋白等现代生物技术产业中应用也日益广泛。米曲霉基因组在2005年已经测序完成，但是由于米曲霉对G418、潮霉素、寡霉素、博来霉素、腐草霉素、卡那霉素等常用的抗性药物均不敏感，因此其遗传操作困难，使得米曲霉功能基因研究进展缓慢。真菌常用的转基因方法有原生质体介导和农杆菌介导的两种。前者具有培养难度大、再生频率低、周期长并且操作复杂等缺点，使得其应用有一定局限性。而后者具有操作简单、转化效率高，并且T-DNA插入基因组稳定遗传等优点。虽然农杆菌介导的转基因技术在其它真菌比如酵母、红曲霉、黑曲霉中均已成功，但是由于米曲霉目前可用的抗性筛选标记较少和自身生长特性的原因，在这些常规孢子浓度、共培养时间和温度下均无法实现转基因。目前，使用农杆菌转化米曲霉一直为国际研究热点，2016国际上首次建立了通过Ura/Uri营养缺陷型为筛选标记的米曲霉转基因体系，确定了孢子浓度、共培养时间和温度等条件，使得农杆菌转化米曲霉成为可能性。而以吡啶硫胺素为筛选标记的最大好处是，不用构建营养缺陷型米曲霉，直接以野生型为背景进行转基因。但是目前使用吡啶硫胺素为筛选标记的农杆菌转基因并未获得成功过，其主要原因可能是共培养时间和温度不合适，或者是双元载体不利用目的基因转化等。因此，目前米曲霉转基因主要依赖于原生质体介导的转基因技术。而目前在米曲霉中并无以吡啶硫胺素为筛选标记的农杆菌转基因的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，以解决现有技术中针对米曲霉的转基因方法难以由农杆菌来介导的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是常规以原生质体介导的米曲霉转基因方法其工作量较大、转化效率较低。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，包括以下步骤：1)以pPTRⅠ载体为模板，以序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增，得到ptrA表达盒；通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将pEX1载体双酶切，将酶切产物与所述ptrA表达盒连接，得到pEX1-ptrA载体；将所述pEX1-ptrA载体转化至感受态的农杆菌AGL1株；2)将米曲霉3.042株的孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子；将收集物过滤后以4000rpm的转速离心10min，再用蒸馏水洗涤2次，得到孢子与水的混合物，调整其中孢子浓度至106个/mL，即得到孢子悬液；3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1株接种至10mL同时具有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB培养基中，以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养；取1mL该培养液与9mLIM液体培养基混合，而后以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养6h，得到菌液；4)取100μL步骤3)所得菌液和100μL步骤2)所得孢子悬液，共涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基上，于22℃、避光培养48h；5)将玻璃纸取出，覆盖到同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，30℃培养5～7d；挑取长出的菌落，接种至另一新鲜的、同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，培养，长出的菌落即为阳性转化子。作为优选，还包括以下步骤6)：取步骤5)所得的阳性转化子，提取其DNA，使用GFP特异性引物通过PCR验证其是否为阳性转化子，同时利用荧光显微镜观察GFP。作为优选，步骤1)中所述ptrA表达盒的长度为2000bp。作为优选，步骤1)中酶切产物与ptrA表达盒是通过infusion方式进行连接的。作为优选，步骤3)所述IM液体培养基是通过以下方法配制的：40mMMES，5mM葡萄糖，0.5％(w/v)甘油和200μM乙酰丁香酮溶于MM盐溶液。作为优选，每1L所述MM盐溶液含有以下成分：K2HPO42.05g，KH2PO41.45g，NaCl0.15g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·6H2O0.1g，(NH4)2SO40.5g，FeSO4·7H2O0.0025g。作为优选，步骤3)中，所述1mL该培养液与9mLIM液体培养基混合之后，其OD600值为0.2～0.3。作为优选，步骤3)中，所述摇瓶培养6h之后，其中OD600值为0.6～0.8。作为优选，步骤6)中，所述GFP特异性引物的序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。在以上技术方案中，所使用的载体pPTRⅠ、pEX1，其具体信息可通过以下文献获知：Kubodera,T.,N.YamashitaandA.Nishimura(2000)."PyrithiamineResistanceGene(ptrA)ofAspergillusoryzae:Cloning,CharacterizationandApplicationasaDominantSelectableMarkerforTransformation."BioscienceBiotechnology&Biochemistry64(7):1416.Nguyen,K.T.,Q.N.Ho,T.H.Pham,T.N.PhanandV.T.Tran(2016)."TheconstructionanduseofversatilebinaryvectorscarryingpyrGauxotrophicmarkerandfluorescentreportergenesforAgrobacterium-mediatedtransformationofAspergillusoryzae."WorldJMicrobiolBiotechnol32(12):204.本专利技术提供了一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，该方法主要包括以下步骤：(1)将植物双元载体改造成含有prtA表达盒的双元表达载体，含有GPDA启动子和GPF报告基因；(2)双元载体转化农杆菌AGL1；(3)在DPY培养基培养野生型米曲霉3.042，3天后洗下孢子；(4)孢子与含有目的载体的农杆菌共培养48小时；(5)共培养后的孢子转移到含有头孢和吡啶硫胺素的CD培养基筛选；(6)筛选培养基生长出来的转化子进一步验证。本专利技术首次建立了农杆菌介导的以吡啶硫胺素为筛选标记的转基因体系，较原来的原生质体介导的转基因体系减少工作量，提高了转化效率，为米曲霉遗传操作奠定了基础。附图说明图1是pEX1-ptrA载体构建过程的原理图及相应的PCR电泳结果图；图2是在筛选培养基上所生长的转化子的菌落图；图3是利用新的筛选培养基进一步培养转化子的菌落图；图4中分别是明场条件下及荧光显微镜下所观察的菌体图；图中绿色荧光物为含有GFP的菌体。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)以pPTRⅠ载体为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增，得到ptrA表达盒；通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将pEX1载体双酶切，将酶切产物与所述ptrA表达盒连接，得到pEX1‑ptrA载体；将所述pEX1‑ptrA载体转化至感受态的农杆菌AGL1株；2)将米曲霉3.042株的孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子；将收集物过滤后以4000rpm的转速离心10min，再用蒸馏水洗涤2次，得到孢子与水的混合物，调整其中孢子浓度至106个/mL，即得到孢子悬液；3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1株接种至10mL同时具有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB培养基中，以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养；取1mL该培养液与9mL IM液体培养基混合，而后以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养6h，得到菌液；4)取100μL步骤3)所得菌液和100μL步骤2)所得孢子悬液，共涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基上，于22℃、避光培养48h；5)将玻璃纸取出，覆盖到同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，30℃培养5～7d；挑取长出的菌落，接种至另一新鲜的、同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，培养，长出的菌落即为阳性转化子。...

【技术特征摘要】
1.由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)以pPTRⅠ载体为模板，以序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增，得到ptrA表达盒；通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将pEX1载体双酶切，将酶切产物与所述ptrA表达盒连接，得到pEX1-ptrA载体；将所述pEX1-ptrA载体转化至感受态的农杆菌AGL1株；2)将米曲霉3.042株的孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子；将收集物过滤后以4000rpm的转速离心10min，再用蒸馏水洗涤2次，得到孢子与水的混合物，调整其中孢子浓度至106个/mL，即得到孢子悬液；3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1株接种至10mL同时具有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB培养基中，以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养；取1mL该培养液与9mLIM液体培养基混合，而后以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养6h，得到菌液；4)取100μL步骤3)所得菌液和100μL步骤2)所得孢子悬液，共涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基上，于22℃、避光培养48h；5)将玻璃纸取出，覆盖到同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，30℃培养5～7d；挑取长出的菌落，接种至另一新鲜的、同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，培养，长出的菌落即为阳性转化子。2.根据权利要求1所述的由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于还包括以下步骤6)：取步骤5)所得的阳性转化子，提取其DNA，使用GFP特异性引物通过PCR验证其是否为...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡志宏，曾斌，孙云龙，牛亚丽，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36