针对AHI1基因编辑的sgRNA筛选及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种针对AHI1基因的sgRNA，通过白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系证实了上述序列的编辑效率，证明本发明专利技术的序列具有优异的编辑效率，为以后的AHI1基因疗法提供参考。

Screening and application of sgRNA for AHI1 gene editing

The invention discloses a sgRNA targeting AHI1 gene. The prokaryotic evaluation system verifies the editing efficiency of the sequence, proves that the sequence has excellent editing efficiency, and provides a reference for the future AIHI1 gene therapy.

【技术实现步骤摘要】
针对AHI1基因编辑的sgRNA筛选及应用
本专利技术属于基因技术，具体涉及针对AHI1基因的sgRNA，具有高的编辑效率。
技术介绍
AHI1（AbelsonHelperIntegrationSite1）基因可以促进人类小脑和皮质发育，若发生基因突变，可以出现Joubert综合症。CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/Cas9)基因编辑系统是自ZFNs、TALENs发展而来的第三代基因编辑系统，是从细菌的适应性免疫防御系统中发现，用来对抗外源DNA以及入侵的病毒，目前已经被广泛的应用于生物医学领域。CRISPR/Cas9的特点是其设计简单、成本低廉、识别不受基因甲基化影响、编辑效率高、能同时靶向多个靶点以及含有PAM位点的任意序列等。以前的研究已经证明由crRNA的3'末端与tracrRNA的5'末端形成的sgRNA可以指导Cas9核酸酶剪切与crRNA序列互补的靶序列。剪切靶序列后，细胞修复DNA双链断裂的方式分为同源重组修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）两种。在Shinmyo等人的研究中，3条sgRNA序列被设计用于小鼠大脑Satb2基因的敲除，但是它们之间的编辑效率差别巨大。所以，相对高效率且较低脱靶效应的sgRNA的选择对于CRISPR/Cas9基因编辑的广泛应用是决定性的。评价一个特定靶序列的sgRNA的特异性和有效性，目前有以下几种方法被广泛应用，如T7endonucleaseI实验，PCR产物测序，Digenome-seq技术，GUIDE-seq技术，HTGTS技术，IDLV法和在线工具预测，但这些方法通常费时费力，需要的仪器设备要求较高或者预测不准确。针对特定的靶基因，大量的sgRNA序列可以被设计，因为Cas9酶可以酶切任何毗邻PAM位点的靶序列，但每一条sgRNA的编辑效率都不一样，如PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的高低受到多种因素影响，其中不同sgRNA序列之间特异性的高低对其影响尤为重要。
技术实现思路
本专利技术公开了一种AHI1基因最优sgRNA，为以后的基因疗法提供参考。本专利技术采用如下技术方案：一种针对AHI1基因的sgRNA，所述针对AHI1基因的sgRNA的序列为SEQIDNO.1。一种针对AHI1基因的药物，包括SEQIDNO.1所示的sgRNA。上述技术方案中，所述针对AHI1基因的药物还包括药物载体，比如常规聚合物载体、细胞载体等。一种针对AHI1基因的质粒，包括SEQIDNO.1所示的sgRNA与载体。优选的，所述针对AHI1基因的质粒中，载体为pCas9质粒。本专利技术中所述SEQIDNO.1的序列为：5'-GATAATGTCTCCGCGATGGATGG-3'。本专利技术通过白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系证实了上述序列的编辑效率，为60～62%。因此本专利技术还公开了序列为SEQIDNO.1的sgRNA在制备针对AHI1基因药物中的应用以及在制备针对Joubert综合症药物中的应用。首先，pMD-19T质粒上编码β-gal区域的部分序列被一段含有靶序列的长序列替换，从而形成移码突变，替换后的质粒称为pMD-repeat质粒，单独转化在含有X-gal和IPTG的固体培养基中不能形成蓝色菌落；当与装载有靶序列对应sgRNA的pCas9质粒共转化时，pMD-repeat质粒中靶序列会被sgRNA引导的Cas9蛋白酶切，靶序列前后两段重复序列发生同源重组，使编码β-gal的基因序列由移码恢复为非移码状态，在X-gal和IPTG诱导下，形成蓝色菌落。构建含有sgRNA序列的原核细胞基因敲除pCas9质粒和含有对应靶序列的pMD-repeat质粒，两种质粒等量共转化到DH5α感受态细胞，在含有X-gal-TPTG-氯霉素-氨苄青霉素的培养基培养，观察蓝色菌落占全部菌落比例。构建含有sgRNA序列的真核细胞基因敲除pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒，转染HeLa细胞，发挥基因编辑作用后，提取对照组和实验组中细胞基因组，在sgRNA上下游区域设计引物，Q5高保真酶PCR，产物纯化，T7E1酶消化，琼脂糖凝胶电泳，观察电泳后条带结果；设计测序引物，纯化后的产物测序，观察Cas9酶切位点附近有无套峰以及套峰的高低。数据证明，本专利技术公开了针对AHI1基因的sgRNA具有最优编辑效率。附图说明图1为pCas9质粒的sgRNA克隆示意图；图2为pMD-repeat质粒lacZ基因部分碱基序列图；图3为pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒图；图4为白变蓝克隆形成实验原理示意图；图5为白变蓝克隆形成实验AHI1-sgRNA双质粒共转化菌落图；图6为白变蓝克隆形成实验AHI1-sgRNA双质粒共转化蓝色菌落占总菌落比值图（n=3，mean±SD）；图7为pMD-repeat质粒修复测序图。具体实施方式1.1实验细胞人宫颈癌HeLa细胞株由苏州大学药学院王光辉课题组提供。1.2主要仪器仪器名称厂家4℃冰箱青岛海尔-20℃低温冰箱日本SANYO公司-80℃低温冰箱日本SANYO公司梯度PCR仪杭州朗基5810R低温高速离心机德国Eppendorf公司常温高速离心机德国Eppendorf公司Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司微量移液器德国Eppendorf公司数显鼓风干燥箱上海博讯电子分析天平美国Sartorius公司DK-600B电热恒温水槽上海精宏公司隔水式恒温培养箱上海一恒科学仪器公司凝胶成像分析系统复日科技恒温震荡培养箱上海一恒科学仪器公司DDY-5型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂Airtech净化工作台苏净集团高压灭菌锅上海博讯Nanodrop2000/2000C分光光度计美国Thermo公司CO2培养箱美国Thermo公司IX71型荧光显微镜日本Olympus公司1.3主要试剂1.3.1菌株与载体菌株/载体名称厂家EColi.DH5α菌株北京天根公司PMD-19T(A1360)美国promega公司pCas9质粒北京溯源精微科技有限公司pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）美国Addgene公司1.3.2相关试剂盒试剂盒名称厂家离心柱型质粒小提试剂盒北京天根公司(货号#DP103-03)离心柱型DNA纯化回收试剂盒北京天根公司(货号#DP214-02)血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒北京天根公司(货号#DP304-02)1.3.3其他试剂都为市购产品。1.4试剂溶液配置1.4.1100mg/mL氨苄青霉素用10mLddH2O溶解1g氨苄青霉素，0.22μm过滤膜过滤除菌。每份1mL分装，-20℃贮存。1.4.225mg/mL氯霉素用10mL无水乙醇溶解0.25g氯霉素，0.22μm过滤膜过滤除菌。每份1mL分装，-20℃贮存。1.4.3LB液体培养基称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加入200mL的ddH2O搅拌溶解，配置5mol/L的NaOH溶液调pH到7.0，用ddH2O定容到1L，进行分装（10mLEP管，每管加入5mL），高压蒸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对AHI1基因的sgRNA，所述针对AHI1基因的sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种针对AHI1基因的sgRNA，所述针对AHI1基因的sgRNA的序列为SEQIDNO.1。2.根据权利要求1所述针对AHI1基因的sgRNA，其特征在于，所述针对AHI1基因的sgRNA的编辑效率为60～62%。3.一种针对AHI1基因的药物，包括SEQIDNO.1所示的sgRNA。4.根据权利要求3所述针对AHI1基因的药物，其特征在于，所述针对AHI1基因的药物还包括药物载体。5.根据权利要求4所述针对AHI1基因的药物，其特征在于，所述药物载体为聚合物载...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙万平，奚邦生，刘婉婉，陶静，马建婷，
申请(专利权)人：苏州大学张家港工业技术研究院，苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32