快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法及应用技术

一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法，是以野生型秀丽隐杆线虫为基础，液体培养至2000‑2500虫/mL，待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液至酒精溶液体积终浓度为1％‑5％，干预24h，此时，秀丽隐杆线虫表现为醉酒状态。应用时，直接将药食两用植物的水提取物加入至该醉酒模型中对线虫的各项指标进行检测对比。本方法采用模式生物秀丽隐杆线虫用于评价，方便易得，能有效降低试验成本；秀丽隐杆线虫生长周期短，短时间内能大量繁殖得到成千上万条线虫用于试验，能保证样本量足够的多，减少试验误差，保证评价结果的准确性；可开展高通量筛选试验，高效得出试验结果，试验周期大大缩短。

Establishment and application of a drunken model for rapid detection of nematode Caenorhabditis elegans

A rapid screening method for the establishment of alcoholic model of C. elegans was developed. The model was based on wild C. elegans and was cultured to 2,500 worms/mL in liquid medium. When C. elegans reached the adult stage, the alcohol solution was added into the worm solution to the final concentration of 1%5% of the alcohol solution, and the intervention lasted 24 hours. At this time, the nematode Caenorhabditis elegans showed a state of intoxication. The water extracts from edible and medicinal plants were directly added to the drunken model to detect the nematodes. In this method, the model organism C. elegans was used for evaluation, which was convenient and easy to obtain, and could effectively reduce the cost of the experiment. The high throughput screening test can be carried out, and the test results can be obtained efficiently, and the test cycle is greatly shortened.

【技术实现步骤摘要】
快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种有解酒功效的植物(药食两用)水提物快速筛选的方法，特别涉及一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立方法。
技术介绍
我国酒文化历史悠久，适量饮酒可改善人体血液循环、解除疲劳，但当摄入量超过人体限度后，会产生昏睡、胃出血、肝损伤、神经系统麻痹等症状，对人体造成巨大危害，因此大量具有解酒效果的解酒药(如葛花汤、甘得乐醒酒饮料、醒来悦醒酒饮料、鼎尊醒酒饮料等植物醒酒药)问世。但大多解酒药的药效作用大多通过建立小鼠醉酒模型去验证，通过检测小鼠血液指标及相关代谢酶，以评价作用效果。此方法存在过程较复杂、试验组样本数量限制、试验周期长，且经济成本较高的缺点。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,C.elegans)作为科学研究中常用且非常重要的一种模式动物，具有以下特点和优势：个体较小，成虫约1.5mm长，成本低，便于在实验室上大量培养和操作；生活周期短，在20℃下平均生活史为3.5天，便于快速进行表型分析。因此可利用秀丽隐杆线虫建立一种醉酒模型，以解决小鼠试验的不足之处。
技术实现思路
本专利技术的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法及应用，通过秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立，能从多种药食两用的植物中快速筛选出解酒药效显著的植物，具有高效筛药、降低成本、试验结果可靠的特点。为达上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法，该方法步骤如下：(1)采用常规液体培养法对野生型秀丽隐杆线虫(N2)进行培养，使虫液浓度控制为2000-2500虫/mL，秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50菌液为食；上述提及的虫液浓度是指培养液中秀丽隐杆线虫的浓度；而文中的虫液则是指培养秀丽隐杆线虫后的秀丽隐杆线虫浓度为2000-2500虫/mL的培养液。(2)待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h，此时，秀丽隐杆线虫表现为醉酒状态。上述方法建立的醉酒模型中，秀丽隐杆线虫的头部摆动频率为10-40次/30s、吞咽运动为10-40次/30s、运动轨迹呈现出不协调的正弦波长且有拖尾现象，寿命为10-12d，线虫体内总抗氧化能力为15-25U/mg，氧自由基(ROS)水平为80-100A.U.，线虫体内酒精浓度为30-50ng/μg蛋白。上述提及采用常规液体培养法对野生型秀丽隐杆线虫(N2)进行培养是指参照文献(StiernagleT.MaintenanceofC.elegans[J].Wormbook,2006:1-11.)的方法对秀丽隐杆线虫进行同期化与基础培养。本专利技术同时提供上述方法在快速筛选药食两用解酒植物中的应用。应用时，是将药食两用植物提取物粉末用水完全溶解，并通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5-30mg/mL的体积终浓度加入到上述方法所建立的醉酒模型中，干预24h。干预完后，检测秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫的头部摆动频率为50-100次/30s、吞咽运动为50-90次/30s、运动轨迹呈现出较协调的正弦波长且拖尾现象减弱，寿命为14-20天，线虫体内总抗氧化能力为5-12U/mg及氧自由基(ROS)水平为40-60A.U.，线虫内部酒精浓度为0-30ng/μg蛋白，秀丽隐杆线虫表现出一种趋于正常运动的状态，表示该药食两用植物具有解酒作用，且秀丽隐杆线虫的检测指标(头部摆动频率、吞咽运动、运动轨迹、寿命、总抗氧化能力、氧自由基水平及线虫体内酒精浓度)越趋向于线虫体内无酒精浓度检出时的指标，则表明该药食两用植物解酒作用越显著。上述提及药食两用植物提取物粉末是指将购买的数种药食两用植物分别粉碎成粉，分别以1g:10ml的料液比利用水浸提法反复浸提两次以提取有效成分，过滤，合并两次滤液；然后转至旋转真空浓缩机中进行滤液浓缩，将浓缩液置于玻璃皿中密封，于-80℃冷冻至少2h，最后快速取出，冷冻干燥。与现有技术相比，本专利技术方法的有益效果为：采用秀丽隐杆线虫这种公认的模式生物用于评价，方便易得，能有效降低试验成本；秀丽隐杆线虫生长周期短，短时间内能大量繁殖得到成千上万条线虫用于试验，可以保证样本量足够的多，减少试验误差，保证评价结果的准确性；可开展高通量筛选试验，高效得出试验结果，试验周期大大缩短。具体实施方式实施例1秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立以野生型秀丽隐杆线虫(N2)作为模型建立基础，秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养参照参考文献(StiernagleT.MaintenanceofC.elegans[J].Wormbook,2006:1-11.)中的液体培养法进行。秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50为食，虫液浓度控制为2000-2500虫/mL。此时，检测秀丽隐杆线虫，其头部摆动频率为50-100次/30s、吞咽运动为50-90次/30s、运动轨迹呈现出左右协调的正弦波长，寿命为18-25d，线虫体内总抗氧化能力为5-12U/mg，氧自由基(ROS)水平为40-60A.U.，线虫体内未检出外部摄入的酒精。待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h。此时检测秀丽隐杆线虫，线虫的头部摆动频率为10-40次/30s、吞咽运动为10-40次/30s、运动轨迹呈现出不协调的正弦波长且有拖尾现象，寿命为10-12d，线虫体内总抗氧化能力为15-25U/mg，氧自由基(ROS)水平为80-100A.U.，线虫体内酒精浓度为30-50ng/μg蛋白，此时的线虫表现出醉酒状态。实施例2秀丽隐杆线虫醉酒模型的验证药食两用植物提取物粉末的提取：将购买的多种药食两用植物分别粉碎成粉，并分别按1g:10ml的料液比利用水浸提法反复浸提2次以提取有效成分，过滤，合并2次滤液。然后转至旋转真空浓缩机中进行滤液浓缩，再将浓缩液置于玻璃皿中，密封，放置-80℃冰箱中冷冻至少2h。最后快速取出冷冻后的药皿置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥成粉。方法：设置空白组(虫液+水)、对照组(虫液+酒精溶液)、药物组(虫液+酒精溶液+药液)，其中：空白组：野生型秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养参照参考文献(MaintenanceofC.elegans)中的方法采用液体培养法进行。秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50为食，虫液浓度控制为2000-2500虫/mL。在液体培养基中培育至年轻的成虫，此时，秀丽隐杆线虫体内未检出外部摄入的酒精，各检测指标(头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平)见实施例1中第1段描述。对照组：是在上述空白组的基础上，当秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h。此时，秀丽隐杆线虫为醉酒状态，各检测指标(头部摆动频率、吞咽次数、运动轨迹、寿命、线虫体内总抗氧化能力、氧自由基水平、体内酒精浓度)见实施例1中第2段描述。药物组：是将药食两用植物提取物粉末用水完全溶解后通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法，其特征在于，该方法步骤如下：(1)采用常规液体培养法对野生型秀丽隐杆线虫进行培养，使虫液浓度控制为2000‑2500虫/mL，秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50菌液为食；(2)待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％‑5％，干预24h，此时，秀丽隐杆线虫表现为醉酒状态。

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选解酒植物的秀丽隐杆线虫醉酒模型建立方法，其特征在于，该方法步骤如下：(1)采用常规液体培养法对野生型秀丽隐杆线虫进行培养，使虫液浓度控制为2000-2500虫/mL，秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50菌液为食；(2)待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h，此时，秀丽隐杆线虫表现为醉酒状态。2.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗军，吴中琴，李珂，戴奕杰，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43