一种高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体公开一种高产L‑丙氨酸的基因工程菌及其构建方法。所述高产L‑丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCC No.15180，具有发酵产生高浓度L‑丙氨酸的能力，其是通过敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D‑乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，将人工合成的L‑丙氨酸脱氢酶基因与L‑丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体上得到。本发明专利技术提供的高产L‑丙氨酸的基因工程菌，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸，提高基因表达效率，增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法。
技术介绍
L-丙氨酸在食品和医药领域有着广泛的用途。在食品领域，L-丙氨酸的添加可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速恢复疲劳，振奋精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇饮料的质量等。L-丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合能加强食品、饮料风味。它还可以改善有机酸的酸味，添加后能使有机酸更接近天然果酸的酸味。在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原料，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-《14氨基酸注射液-800》是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒。L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。目前L-丙氨酸的生产是以天门冬氨酸为原料，通过酶催化技术(天冬氨酸脱羧酶)来生产。由于天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本及售价严重依赖于石油价格。而微生物发酵法生产L-丙氨酸和酶催化技术相比有诸多优点：首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作为生产原料。酶催化技术以天冬氨酸为原材料。目前天冬氨酸的生产是以顺酐为原料，顺酐的资源紧张和价格高涨导致天冬氨酸的供给也存在着巨大的隐患。微生物发酵法技术是以葡萄糖为原料。葡萄糖属于可再生生物质资源，目前主要是通过玉米淀粉制得，将来可以从木质纤维素中提炼，成本可以长期保持在稳定的水平。利用葡萄糖为原材料，既有很大的价格优势，又能长期维持价格的稳定。微生物发酵法中大肠杆菌是表达外源基因用于发酵生产有用基因产物的最常用平台微生物之一，丙氨酸的发酵生产以大肠杆菌发酵为主。但是大肠杆菌细胞中丙氨酸的生物合成是在谷氨酰胺-丙酮酸氨基转移酶催化下进行的；此酶催化活性较低，不能满足丙氨酸生产菌株培育的要求，且大肠杆菌体内葡萄糖除了转化为丙氨酸外还有其他代谢途径。因此，在减少大肠杆菌细胞中葡萄糖构成的碳流流向其他代谢途径的前提下，丙氨酸生产菌株多采用向大肠杆菌导入具有较强丙氨酸合成能力的外源基因的方法获得。然而，目前丙氨酸生产菌株多采用引入来自革兰氏阳性菌，特别是芽孢杆菌属菌株的高活性L-丙氨酸脱氢酶基因，但它们的GC含量、密码子偏好与大肠杆菌有较大不同，因此直接在大肠杆菌中引入上述基因极有可能因转录与翻译机制的差异造成外源基因表达量降低，进而影响丙氨酸积累，此外，大肠杆菌L-丙氨酸外运蛋白(alaE)基因在染色体上只有一个拷贝，不能满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累，最终导致合成途径的反馈抑制而影响产量。
技术实现思路
针对现有基因工程大肠杆菌中外源基因表达量低，影响丙氨酸积累量，且大肠杆菌L-丙氨酸外运蛋白不能满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累，最终导致合成途径的反馈抑制而影响产量等问题，本专利技术提供一种高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种高产L-丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCCNo.15180。相对于现有技术，本专利技术提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌，其属大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，该菌株于2018年1月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，其保藏号为CGMCCNo.15180，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖的其他代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。进一步地，本专利技术还提供所述高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法。该构建方法，包括以下步骤：(1)将L-丙氨酸脱氢酶基因按照大肠杆菌的密码子偏好进行优化，并进行全长人工合成，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因；(2)敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因；(3)将步骤(1)中所得的人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到步骤(2)中所得的大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处后，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处；(4)将步骤(3)中所得到的大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L-丙氨酸的基因工程菌。相对于现有技术，本专利技术提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖的其他代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处，人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因更加符合大肠杆菌的密码子偏好，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例中大肠杆菌的葡萄糖代谢过程图及基因敲除和整合的示意图。图2是本专利技术实施例中以ldhA为例的大肠杆菌基因敲除流程图。图3是专利技术实施例中以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus，G.s.)的L-丙氨酸脱氢酶(alaD)基因为例的大肠杆菌基因敲入流程图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种高产L-丙氨酸的基因工程菌。该高产L-丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCCNo.15180。本专利技术实施例提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖流向其它代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。本专利技术在提供该高产L-丙氨酸的基因工程菌的前提下，还进一步提供了该高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法。在一实施例中，该构建方法包括以下步骤：(1)将L-丙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产L‑丙氨酸的基因工程菌，其特征在于：保藏号为CGMCC No.15180。

【技术特征摘要】
1.一种高产L-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于：保藏号为CGMCCNo.15180。2.权利要求1所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将L-丙氨酸脱氢酶基因按照大肠杆菌的密码子偏好进行优化，并进行全长人工合成，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因；(2)敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因；(3)将步骤(1)中所得的人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到步骤(2)中所得的大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处后，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处；(4)将步骤(3)中所得到的大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L-丙氨酸的基因工程菌。3.如权利要求2所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述人工合成的方法为：将L-丙氨酸脱氢酶基因根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化并进行全长人工合成，将tac启动子和转录终止子rrnBT1分别加入到基因的5'和3'端并添加5'-UT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张仲良，张习伟，李霆，王亚森，田晓辉，康明，
申请(专利权)人：河北大学，精晶药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13