一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株制造技术

本发明专利技术公开了一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株。本发明专利技术提供了一种重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。本发明专利技术针对BVDV黏膜免疫的重要性，构建了细胞表面表达BVDV主要保护性抗原E2蛋白的重组乳酸乳球菌表达系统，为BVDV口服活载体疫苗的研制提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株
本专利技术涉及一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒(BovineViralDiarrheaVirus,BVDV)属于黄病毒科(Flavividae)的瘟病毒属(Pestivirus),可引起反刍动物病毒性腹泻/粘膜病(Bovinevirusdiarrhea-mucosaldisease,BVD-MD),临床上以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、妊娠母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。自1946年首次报道该病后，由于缺乏有效的防控技术，在全球普遍流行，给养牛业造成重大的经济损失。疫苗免疫接种是预防该病的主要措施，但灭活疫苗效果不稳定，难以达到预防的目的，弱毒活疫苗存在排散病毒、病毒毒力返强等诸多不安全因素。因此，从BVDV经黏膜感染致病的角度出发，研制能有效的刺激黏膜免疫系统产生免疫应答的口服疫苗对该病的防治具有重要意义。近年来，黏膜疫苗抗原传递系统成为传染病防御领域的新技术热点，目前研究的载体有微粒载体、细菌载体、病毒载体和植物载体，但主要集中在减毒的细菌菌株上，即活菌载体。活菌载体疫苗是黏膜免疫疫苗的重要组成部分，也是当今研究的热点。乳酸杆菌作为食品安全级的微生物，是动物和人体内的正常菌群，能长期的定植于机体内发挥其促进营养物质分子降解和吸收、维持肠道内菌落平衡、调节免疫系统作用等益生作用。因此，以乳酸菌为载体作为外源基因的传递和表达系统研制口服疫苗，具有重要开发前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株。本专利技术提供了一种重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。所述特异DNA包括Usp45信号肽的编码序列和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’端第106-1140位所示。所述特异DNA由Usp45信号肽的编码序列、6×His标签的编码序列和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因组成。所述Usp45信号肽的编码序列如序列表的序列1自5’端第7-87位所示。所述特异DNA如序列表的序列1所示。所述特异DNA编码序列表的序列2所示的蛋白质。所述特异DNA通过含有特异DNA的表达载体导入乳酸乳球菌。所述表达载体为将含有特异DNA的片段插入pNZ8148表达载体的多克隆位点中得到的。所述表达载体为采用序列表的序列1自5’端第5-1140位所示的双链DNA分子替代pNZ8148表达载体的XbaI和NcoⅠ酶切位点间的片段得到重组表达载体。以上任一所述乳酸乳球菌具体可为乳酸乳球菌NZ9000。本专利技术还保护以上任一所述的重组菌在作为牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。所述牛病毒性腹泻病毒疫苗的免疫方式为口腔灌服。本专利技术还保护以上任一所述的重组菌在制备牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。本专利技术还保护以上任一所述的重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防牛病毒性腹泻病毒感染。本专利技术还保护一种牛病毒性腹泻病毒疫苗，其活性成分为以上任一所述的重组菌。本专利技术还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述的重组菌；所述产品的用途为预防牛病毒性腹泻病毒感染。本专利技术针对BVDV黏膜免疫的重要性，构建了细胞表面表达BVDV主要保护性抗原E2蛋白的重组乳酸乳球菌表达系统，为BVDV口服活载体疫苗的研制提供基础。附图说明图1为SDS-PAGE电泳检测E2基因在乳酸菌中的表达情况。图2为重组菌pNZ8148-E2/NZ9000表达产物Western-blot分析。图3为血清中BVDVE2特异性抗体效价的动态变化规律。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pNZ8148表达载体：上海北诺生物科技有限公司。乳酸乳球菌NZ9000：上海北诺生物科技有限公司。实施例1、表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌的构建一、重组表达载体的构建采用序列表的序列1自5’端第5-1140位所示的双链DNA分子替代pNZ8148表达载体的XbaI和NcoⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体(已经测序验证)。插入序列与载体序列融合形成序列1。序列表的序列1中，自5’端第7至87位为Usp45信号肽的编码序列，第88至105位为6×His标签的编码序列，第106至1140位为优化后的E2基因序列。优化后的E2基因更适于在乳酸菌中表达。序列表的序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。序列表的序列2中，第3至29位为Usp45信号肽，第30至35位为6×His，第36至379位为E2蛋白。二、重组乳酸菌的构建及蛋白表达鉴定1、将步骤一得到的重组表达载体导入乳酸乳球菌NZ9000，得到重组菌pNZ8148-E2/NZ9000。2、将步骤1得到的重组菌接种于5ml含有0.5％(质量百分含量)葡萄糖和10g/ml氯霉素的M17液体培养基中，30℃、150rpm过夜培养。3、完成步骤2后，将重组菌菌液按1:25接种于含有0.5％(质量百分含量)葡萄糖和10g/ml氯霉素的M17液体培养基中，30℃、150rpm培养至菌液OD600nm约为0.4。4、完成步骤3后，取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，取上清液(重组菌诱导0h上清)，沉淀用100μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液重悬(重组菌诱导0h全菌)。剩余的培养体系中加入乳链菌肽(Nisin)(在培养体系中的浓度为1ng/ml)，30℃培养不同时间(2h、4h或8h)，诱导融合蛋白表达，取出1ml培养物(重组菌诱导2、4和8h上清)，10000r/min室温离心2min，取上清液，沉淀用100μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液重悬(重组菌诱导2、4和8h全菌)。5、采用乳酸乳球菌NZ9000替代重组菌，按照步骤2-4进行操作，得到NZ9000菌株未诱导上清、NZ9000菌株未诱导全菌和NZ9000菌株诱导全菌(诱导4h)。6、采用pNZ8148表达载体替代重组表达载体，按照步骤1-5进行操作，得到重组菌pNZ8148/NZ9000。将上述过程中的样品进行SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。结果如图1所示。图1中，M:蛋白质分子质量标准；泳道1：NZ9000菌株未诱导上清培养液；泳道2：NZ9000菌株未诱导全菌；泳道3：NZ9000菌株诱导全菌；4-7：pNZ8148-E2阳性菌株诱导后0、2、4和8h上清培养液；8-11:pNZ8148-E2阳性菌株诱导后0、2、4和8h全菌。结果表明，重组蛋白在菌体裂解物中获得了表达，为非分泌性表达，蛋白大小约为41.69KD，所表达蛋白与预期大小相符。7、将上述过程中的样品进行western检测分析。一抗为BVDVE2兔多克隆抗体(Biorbyt公司，货号；orb312169)，稀释比例为1；2000。二抗为山羊抗兔IgGH&L(HRP)(Abca本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。

【技术特征摘要】
1.重组菌，是将特异DNA导入乳酸乳球菌中得到的；所述特异DNA包括牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述特异DNA包括Usp45信号肽的编码序列和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因。3.如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’端第106-1140所示。4.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述特异DNA如序列表的序列1所示。5.如权利要求1至3任一所述的重组菌，其特征在于：所述特异DNA通过含有特异DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：何延华，黄新，张星星，韩猛立，吴桐忠，钟发刚，甘尚权，张云峰，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：新疆,65