一种可溶-不溶性UCST型PMAAc载体、其固定化酶及应用制造技术

本发明专利技术属于固定化酶技术领域，涉及一种可溶‑不溶性UCST型PMAAc载体、其固定化酶及应用，尤其涉及一种可溶‑不溶性高临界溶解温度（UCST）型聚甲基丙烯酸钠盐（PMAAc）载体的制备方法和固定化酶的应用及其固定化酶降解纤维素材料的应用；本发明专利技术将丙烯酸和过硫酸铵用去离子水溶解，缓慢滴加由去离子水溶解的甲基丙烯酰胺，摇匀后通氮气鼓泡后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，磁力搅拌反应，冷却后离心，去上清，用去离子水升温重悬材料后得到产物；本发明专利技术的载体用于固定化纤维素酶，并将其用于降解纤维素材料，本发明专利技术得到的固定化酶贮藏稳定性和重复利用效果俱佳，水解催化纤维素材料的效率也显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种可溶-不溶性UCST型PMAAc载体、其固定化酶及应用
本专利技术属于固定化酶
，涉及一种UCST型PMAAc载体、其固定化酶及应用，尤其涉及一种可溶-不溶性高临界溶解温度（UCST）型甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物（PMAAc）载体的制备方法和固定化纤维素酶、及共固定化纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的应用。
技术介绍
纤维素是地球上最丰富的资源之一，通过化学和生物方法能使其转化成功能多样化的葡萄糖。目前化石能源危机愈加严重，将生物质能的葡萄糖转化成燃料乙醇的这一绿色途径正成为能源行业的一大研究热点。由于游离酶很难回收利用，而且经过长时间的酶解，酶活力容易损失，这些是抑制其工业化应用的主要障碍。固定化酶因其分离快速简单方便，稳定性高，回收利用率高，从而降低了酶的应用成本，受到研究者们青睐。磁性纳米材料作为备受关注的一种新型固定化载体，主要是通过物理吸附法和化学共价结合法固定化酶，然而由于催化不溶性底物时存在较大扩散传质和空间位阻，导致其催化效率较低，且不利于分离和回收利用。目前，刺激响应性聚合物作为一种可逆可溶-不可溶材料，通过外部刺激在溶解状态下进行催化水解后分离底物，以沉淀状态分离以回收利用，从而解决固体酶制剂与不溶性底物难以分离的问题。与其他刺激条件如pH、光和力相比，温度调控简单且酶活力不易损失。温度响应性材料中研究最为广泛的是低临界溶解温度（LCST）型聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）及其衍生聚合物，其低临界溶解温度一般在33℃左右，而纤维素酶的最佳催化温度为50℃，所以LCST型固定化酶不能高效催化水解纤维素，而寻求一种高临界溶解温度型载体材料固定化酶降解纤维素是迫切且必需的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服固定化酶难回收，同时合成的固定化酶对于纤维素水解效率低下的问题，从而合成可溶-不溶性高临界溶解温度（UCST）型载体聚甲基丙烯酸钠盐（PMAAc）来固定化纤维素酶、及共固定化纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：本专利技术提供一种新型的可溶-不溶性UCST型PMAAc载体，它是利用两种单体甲基丙烯酰胺（MAA）和丙烯酸（AAc）合成得到，具有高临界溶解温度16℃。本专利技术还提供一种新型的可溶-不溶性UCST型PMAAc载体的制备方法，具体步骤如下：可溶-不溶性高临界溶解温度（UCST）型甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物（PMAAc）载体的制备：常温下，将丙烯酸（AAc）和过硫酸铵（APS）用去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢滴加由去离子水溶解的一定量的甲基丙烯酰胺（MAA），摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，60℃条件下磁力搅拌反应后取出，冷却后离心，去上清，用去离子水升温重悬材料，重复三次后得到产物，于40℃真空干燥箱中过夜烘干后得到透明胶状产物，即为可溶-不溶性高临界溶解温度（UCST）型甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物（PMAAc）载体。将适量的可溶-不溶性高临界溶解温度（UCST）型甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物（PMAAc）载体溶液引流入玻璃试管中，悬挂一支温度计于溶液中，置于50℃恒温水浴锅中，使温度平稳下降直到溶液开始出现浑浊，以确定其浊点。其中，所述丙烯酸加入量为1-1.88g，优选1.44g；所述过硫酸铵加入量为0.022-0.042g，优选0.032g；所述去离子水优选加入量10mL。所述甲基苯烯酸的加入量为0.32-0.52g，优选0.42g；所述溶解用去离子水加入量优选10mL。所述磁力搅拌反应时间为3.5-4.5h，优选4h；根据上述方法制备的酶固定化载体材料可溶-不溶性UCST型PMAAc载体用于纤维素酶的固定化以及纤维素酶和β-葡萄糖苷酶共同固定化；具体的，所述可溶-不溶性UCST型PMAAc载体固定化纤维素酶的方法如下：称取可溶-不溶性UCST型PMAAc载体，加入磷酸盐缓冲溶液（pH5.0），后置于50℃水浴锅中使其溶解，加入一定浓度的戊二醛混合后置于50℃振荡培养箱中振荡培养5小时后取出，降温离心取出上清，用适量去离子水升温重悬活化后的载体3次后，加入一定量的纤维素酶充分溶解后置于35℃振荡培养箱中振荡培养4小时后取出，接着测固定化酶的浊点，降温离心，反复清洗3次，上清保留测蛋白质浓度，得到的固定化纤维素酶材料放置在4℃冰箱中保存。其中，所述载体PMAAc加入量为15-25mg，优选20mg；所述磷酸盐缓冲溶液用量1mL；所述戊二醛的浓度为35-45μg/mL，用量为1.5mL；所述纤维素酶的浓度为3-5mg。所述可溶-不溶性UCST型PMAAc载体共同固定纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的方法如下：称取可溶-不溶性UCST型载体共聚物PMAAc，加入1mL磷酸盐缓冲溶液（pH5.0），后置于50℃水浴锅中使其溶解，加入1.5mL一定浓度的戊二醛混合后置于50℃振荡培养箱中振荡培养5小时后取出，降温离心取出上清，用适量去离子水升温重悬活化后的载体3次后，后加入一定量的纤维素酶和一定量的β-葡萄糖苷酶充分混溶后置于35℃振荡培养箱中振荡培养4小时后取出，接着测固定化酶的浊点，降温离心，反复清洗3次，得到的共固定化酶材料放置在4℃冰箱中保存。其中，所述载体PMAAc加入量为15-25mg，优选20mg；所述戊二醛的浓度为35-45μg/mL；所述纤维素酶的浓度为3-5mg；所述β-葡萄糖苷酶加入量为1-2.2mg。本专利技术还提供一种可溶-不溶性UCST型PMAAc载体纤维素酶，以及可溶-不溶性UCST型PMAAc载体共同固定纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。本专利技术另一目的是将上述合成的新型的可溶-不溶性UCST型PMAAc载体固定化纤维素酶，以及可溶-不溶性UCST型PMAAc载体共同固定纤维素酶和β-葡萄糖苷酶用于纤维素材料的降解。与现有技术相比较，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术通过一步法即可合成该载体，产物得率较高，约90%；本专利技术通过浊点法测定共聚物PMAAc的UCST温度为16℃，固定化酶的UCST温度为19℃。通过红外光谱，扫描电镜，荧光标记等手段验证了纤维素酶成功地共价结合在载体表面上。（2）本专利技术验证了固定化纤维素酶的酶学性质，其在稳定性方面有很大的提高。固定化酶不仅拓宽了催化作用的pH及温度范围，且耐酸碱性及热稳定性效果显著了，其在70℃高温下培养5小时，仍然保留了50%左右的相对酶活力。固定化酶贮藏稳定性和重复利用效果俱佳，储存于4℃冰箱30天后，保留酶活力达到了近65%；催化CMC循环10次后，其相对酶活力高达82.4%。（3）本专利技术考察了固定化纤维素酶水解微晶纤维素的效果，并将β-葡萄糖苷酶补充加入纤维素酶共同固定化后进行水解反应。结果显示，一定浓度范围内，催化水解等量的底物，纤维素酶浓度越高，糖化率越高；固定化的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶质量比为2.5:1时，其水解效率最高，是固定化纤维素酶的近3倍，且水解循环8次后，糖化率达到了61%。可溶-不溶性UCST型PMAAc载体固定化酶能够在较高温（＞19℃）的可溶状态下进行水解固体底物，有利于充分接触，加速水解，在较低温（＜5℃）下即可进行分离，快速简单，这不仅解决了LCST型低效水解问题，还能避免分离时不必要的酶活力损失。本专利技术设计合成了可溶-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可溶‑不溶性UCST型载体共聚物PMAAc载体，其特征在于，所述载体是利用两种单体甲基丙烯酰胺（MAA）和丙烯酸（AAc）合成得到，具有高临界溶解温度。

【技术特征摘要】
1.一种可溶-不溶性UCST型载体共聚物PMAAc载体，其特征在于，所述载体是利用两种单体甲基丙烯酰胺（MAA）和丙烯酸（AAc）合成得到，具有高临界溶解温度。2.权利要求1所述的一种可溶-不溶性UCST型载体共聚物PMAAc载体的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：常温下，将丙烯酸和过硫酸铵用去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢滴加由去离子水溶解的一定量的甲基丙烯酰胺，摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，磁力搅拌反应一段时间后取出，冷却后离心，去上清，用去离子水升温重悬材料后得到产物，于真空干燥箱中过夜烘干后得到透明胶状产物。3.根据权利要求2所述的一种可溶-不溶性UCST型载体共聚物PMAAc载体的制备方法，其特征在于，其中，所述丙烯酸加入量为1-1.88g，优选1.44g；所述过硫酸铵加入量为0.022-0.042g，优选0.032g；所述去离子水优选加入量10mL。4.根据权利要求2所述的一种可溶-不溶性UC...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗鹏，韩娟，王赟，万靖，李春梅，倪良，王蕾，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32