一种分离单子叶植物保卫细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种分离单子叶植物保卫细胞的方法，包括以下步骤：(1)取小麦种子，诱导萌芽；(2)步骤(1)中的小麦种子生长到第一片叶未展开前，将胚芽鞘从种胚处剪断、剥离，将胚芽鞘纵切均分成两半，撕取表皮条；(3)将步骤(2)制得的表皮条置于酶解液中进行酶解；(4)清洗步骤(3)制得的表皮条；(5)将洗好的表皮条置于显微镜下镜检。本发明专利技术所述方法，通过使用含有较少类型细胞的小麦胚芽鞘，撕取表皮细胞，再经酶解液的酶解处理，经酶解处理后的胚芽鞘经过清洗，最终获得了高纯度、高活性的哑铃形的小麦保卫细胞，分离出的保卫细胞可用于转录组、蛋白质组和代谢组学研究。

A method for isolation of guard cells from moncotyledon plants

The invention provides a method for separating guard cells of monocotyledon plants, which comprises the following steps: (1) taking wheat seeds and inducing germination; (2) cutting and stripping the coleoptile from the seed embryo before the first leaf is unfolded, and dividing the coleoptile lengthwise into two halves, and tearing off the epidermal strips; (3) taking steps. Suddenly (2) the epidermal strips were placed in the enzymatic hydrolysate for enzymatic hydrolysis; (4) the epidermal strips prepared by the cleaning step (3); and (5) the washed epidermal strips were examined under microscope. By using the wheat coleoptile containing fewer types of cells, the epidermal cells are torn off, the coleoptile is treated by enzymatic hydrolysis, and the coleoptile is cleaned after enzymatic hydrolysis. Finally, the high purity and high activity dumbbell-shaped wheat guard cells are obtained, and the isolated guard cells can be used for transcription group. Proteomics and metabonomics.

【技术实现步骤摘要】
一种分离单子叶植物保卫细胞的方法
本专利技术属于植物生理学领域，涉及一种获得单子叶植物单一类型细胞方法，更具体的说，涉及一种分离单子叶植物保卫细胞的方法。
技术介绍
植物体表面的气孔由两个保卫细胞围成，控制CO2的吸收和水分的散失，进而影响植物的光合作用和蒸腾作用。保卫细胞能感知环境因子的变化，通过调整气孔开度来应答环境的变化。气孔的开度由保卫细胞的膨压决定，当保卫细胞内的渗透调节物质浓度升高时，水势下降，水分由周围细胞流入保卫细胞，使其膨压增加，气孔张开，反之，气孔会关闭。在水分胁迫或病菌侵染等情况下，保卫细胞迅速启动信号转导系统，通过减小气孔开度，提高耐旱和抗病能力。因而，鉴定信号组分对揭示气孔逆境应答机制非常重要。前人已鉴定了拟南芥肾形保卫细胞的信号组分。而小麦等主要农作物的保卫细胞多为哑铃形，在保卫细胞外还有紧密相接的副卫细胞，使得气孔调控更加精确高效，但因二者很难分开，导致分子机理研究受限。分离保卫细胞原生质体，然后采用系统生物学的方法，对保卫细胞转录组、蛋白质组和代谢组等组学水平的变化进行分析，有利于发现起关键作用的生物学过程和起节点作用的信号组分。提取微量或大量的单一类型细胞进行系统生物学的研究，可排除不同组织细胞异质性的干扰，结果更准确，这在拟南芥等肾形保卫细胞上的研究取得成功。公开号为CN104152396A的中国专利公开了一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法，棉花具有肾形保卫细胞。该方法包括诱导棉花种子萌发、酶解分离保卫细胞原生质体、离心等步骤。但是哑铃形保卫细胞的分离仍面临两大困难：表皮中既有长细胞，也有保卫细胞、副卫细胞、表皮毛、硅化细胞、栓化细胞和边刺等特化细胞，保卫细胞不易从其他细胞中分离出来；而且细胞壁外的角质层较厚，不利于酶解溶液对细胞壁的解离。尽管肾形保卫细胞信号通路的研究非常深入，但是哑铃形保卫细胞的研究却因诸多限制因素而停滞不前。由于主要农作物水稻、小麦和玉米均具有哑铃形保卫细胞，相关研究的滞后限制了农作物抗逆的理论完善和遗传改良。根据现有的研究报道，高等植物保卫细胞分离方法可分为两大类：一是显微操作分离法，二是游离原生质体法。显微操作分离法包括激光捕获显微切割法和人工显微分离法，但是这两种方法在保卫细胞研究中应用比较有限，原因在于这两种方法对材料准备、设备和操作技术的要求都比较高，且分离的细胞量有限，不利于后期研究和技术方法的推广。游离原生质体法对设备要求较低，可获得大量细胞，但在分离过程中会对细胞造成较大伤害。鉴于系统生物学是机理解析和关键基因发掘的重要方法，我们对限制该方法使用的保卫细胞的分离问题进行了集中研究，成功获得了高纯度和高生理活性的小麦保卫细胞，为相关研究奠定基础。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种分离单子叶植物保卫细胞的方法，该方法能有效的获得高纯度和高生理活性的保卫细胞，排除副卫细胞、硅化细胞等杂质细胞对后续实验的干扰，分离出的保卫细胞可用于转录组、蛋白质组和代谢组学研究。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种分离单子叶植物保卫细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)取小麦种子，诱导小麦种子萌芽；(2)步骤(1)中的小麦种子生长到第一片叶未展开前，将胚芽鞘从种胚处剪断、剥离，将胚芽鞘纵切均分成两半，撕取表皮条；(3)将步骤(2)制得的表皮条置于酶解液中进行震荡孵育酶解；(4)将步骤(3)制得的表皮条置于无RNA酶水中来回摆动清洗；(5)将步骤(4)制得的表皮条置于显微镜下镜检，确认保卫细胞的完整且没有其他细胞残留。进一步的，步骤(3)中的酶解温度为20-40℃，酶解时间为60-120分钟。进一步的，步骤(3)中的酶解液的组成包括：质量体积百分浓度为1.5％的纤维素酶R-10、质量体积百分浓度为0.5％的离析酶R-10、0.1ku/ml的RNA酶抑制剂、体积百分浓度为85％的基础液，其中基础液的组成包括：560mmol/L的D-山梨醇、5mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸、0.5mmol/L的氯化钙、0.5mmol/L的氯化镁、10μmol/L的磷酸二氢钾，基础液用三羟甲基氨基甲烷调节pH至5.5。进一步的，步骤(3)中的酶解液中还包括两种转录抑制剂：虫草素和放线菌素D，虫草素的浓度为100mg/L，放线菌素D的浓度为33mg/L。进一步的，步骤(1)中诱导小麦种子萌芽的具体步骤为：用75％乙醇对小麦种子的表面消毒0.5～2min，蒸馏水冲洗2遍，再用质量体积百分浓度为0.1％的HgCl2浸泡3～8min，蒸馏水冲洗3遍，将冲洗过的小麦种子均匀摆放在铺有三层湿润滤纸的培养皿中，在22～28℃、40％～60％湿度条件下黑暗培养至种子露白，然后用1200～1800Lx光照培养，光/暗周期为12h/12h。进一步的，步骤(1)中的小麦种子为挑选的饱满一致的小麦种子。相对于现有技术，本专利技术所述的分离单子叶植物保卫细胞的方法具有以下优势：本专利技术所述的分离单子叶植物保卫细胞的方法，通过使用含有较少类型细胞的小麦胚芽鞘，撕取表皮，再经酶解液的酶解处理，经酶解处理后的胚芽鞘经过清洗，最终成功获得了高纯度、高活性的哑铃形的单子叶保卫细胞，本方法在选材、酶解、清洗等方面进行了创新，分离出的保卫细胞可用于转录组、蛋白质组和代谢组学研究。附图说明图1为实施例得到的保卫细胞的显微图像；图2为实施例分离得到的保卫细胞的生物活性检测显微图像；图3为对比例1的撕取下来的表皮条的刮制前后的显微图像；图4为对比例2分离得到的保卫细胞的显微图像。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例及附图来详细说明本专利技术。实施例1.酶解液的准备酶解液的组成包括：质量体积百分浓度为1.5％的纤维素酶R-10、质量体积百分浓度为0.5％的离析酶R-10、0.1ku/ml的RNA酶抑制剂(RNA酶抑制剂为购自于上海生工生物公司的核糖核酸酶抑制剂，产品编号为：B600478-0001)、体积百分浓度为85％的基础液。其中基础液的组成包括：560mmol/L的D-山梨醇、5mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸、0.5mmol/L的氯化钙、0.5mmol/L的氯化镁、10μmol/L的磷酸二氢钾，基础液用三羟甲基氨基甲烷调节pH至5.5。此外，为避免酶解过程中高温和机械伤害对细胞内基因转录表达的诱导，酶解液中还加入了两种转录抑制剂：虫草素和放线菌素D，虫草素的浓度为100mg/L，放线菌素D的浓度为33mg/L。2.实验步骤该方法具体包括以下步骤：(1)挑选饱满一致的小麦种子，诱导小麦种子萌芽，其中诱导小麦种子萌芽的具体步骤为：用75％乙醇对小麦种子表面消毒1min，蒸馏水冲洗2遍，再用质量体积百分浓度为0.1％的HgCl2浸泡5min，蒸馏水冲洗3遍，将冲洗过的小麦种子均匀摆放在铺有三层湿润滤纸的培养皿中，在25℃、50％湿度条件下黑暗培养至种子露白，然后用1500Lx光照培养，光/暗周期为12h/12h；(2)步骤(1)中的小麦种子生长到第一片叶未展开前，将胚芽鞘从种胚处剪断、剥离，将胚芽鞘纵切均分成两半本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离单子叶植物保卫细胞的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)取小麦种子，诱导小麦种子萌芽；(2)步骤(1)中的小麦种子生长到第一片叶未展开前，将胚芽鞘从种胚处剪断、剥离，将胚芽鞘纵切均分成两半，撕取表皮条；(3)将步骤(2)制得的表皮条置于酶解液中进行震荡孵育酶解；(4)将步骤(3)制得的表皮条置于无RNA酶水中来回摆动清洗；(5)将步骤(4)制得的表皮条置于显微镜下镜检，确认保卫细胞完整且没有其他细胞残留。

【技术特征摘要】
1.一种分离单子叶植物保卫细胞的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)取小麦种子，诱导小麦种子萌芽；(2)步骤(1)中的小麦种子生长到第一片叶未展开前，将胚芽鞘从种胚处剪断、剥离，将胚芽鞘纵切均分成两半，撕取表皮条；(3)将步骤(2)制得的表皮条置于酶解液中进行震荡孵育酶解；(4)将步骤(3)制得的表皮条置于无RNA酶水中来回摆动清洗；(5)将步骤(4)制得的表皮条置于显微镜下镜检，确认保卫细胞完整且没有其他细胞残留。2.根据权利要求1所述的分离单子叶植物保卫细胞的方法，其特征在于：步骤(3)中的酶解温度为20-40℃，酶解时间为60-120分钟。3.根据权利要求2所述的分离单子叶植物保卫细胞的方法，其特征在于：步骤(3)中的酶解液的组成包括：质量体积百分浓度为1.4～2.0％的纤维素酶R-10、质量体积百分浓度为0.4～0.6％的离析酶R-10、0.05～0.15ku/ml的RNA酶抑制剂、体积百分浓度为80～90％的基础液，其中基础液的组成包括：500～600mmol/L的D-山梨醇、4～6mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸、0.4～0.6mmol/L的氯化钙、0.4～0.6mmol/L的氯化镁、8～12μmol/L的磷酸二氢钾，基础液用三羟甲基氨基甲烷调节pH至5～6。4.根据权利要求3所述的分离单子叶植物保卫细胞的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王俊斌，谢晓东，吴天文，李扬，陈小强，丁博，李明，苗琛，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12