黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄酮醇3‑O‑半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，该基因从苹果果皮中分离获得，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。本发明专利技术首次克隆并验证了苹果黄酮醇3‑O‑半乳糖苷合成相关的MdUGT75B1基因的功能。通过构建重组质粒，实现了MdUGT75B1基因在大肠杆菌中的重组表达，并得到纯化的重组蛋白。在体外，重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3‑O‑半乳糖苷。本发明专利技术可用于植物黄酮醇糖苷的生物合成调控，应用于植物黄酮醇含量和组分改良的基因工程中，并为实现黄酮醇糖苷类物质商品化生产提供了代谢工程基础。

Flavonol 3-O- galactotransferase MdUGT75B1 gene and its encoded protein and Application

The invention discloses a flavonol 3_O_galactosyltransferase MdUGT75B1 gene, which is isolated from Apple peel, and its nucleotide sequence is shown as SEQ:NO.1, and the amino acid sequence encoding the protein is shown as SEQ:NO.2. The function of the MdUGT75B1 gene related to the synthesis of Apple flavonol 3_O_galactoside was cloned and verified for the first time. The recombinant expression of MdUGT75B1 gene in E. coli was achieved by constructing the recombinant plasmid, and the purified recombinant protein was obtained. In vitro, the recombinant protein can efficiently convert quercetin into quercetin 3, O galactoside. The invention can be used for regulating the biosynthesis of plant flavonol glycosides, applying to genetic engineering for improving the content and composition of plant flavonol glycosides, and providing a metabolic engineering basis for realizing the commercial production of flavonol glycosides.

【技术实现步骤摘要】
黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用
本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用。
技术介绍
苹果(Malus×domestica)系蔷薇科李属果树，是世界五大栽培果树之一，因果实的甘甜风味及其保健功效而受广大消费者喜爱。黄酮醇是苹果果实中富含的一类重要的黄酮类化合物，具有消炎，抗肿瘤，抗氧化，保护神经系统，预防心血管疾病和糖尿病等医药学活性，且在植物生长发育和抵抗逆境等方面具有重要作用。黄酮醇通常以糖苷的形式存在于植物细胞的液泡中，苹果中的黄酮醇主要为槲皮素及其糖苷，包括槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-芸香糖苷和槲皮素3-O-鼠李糖苷等。糖基化主要发生在细胞质中，在糖基转移酶的催化下，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子上，是一种广泛存在的化合物修饰方式，也是许多次生代谢产物合成反应的最后一步。糖基化可以改变黄酮醇化合物的亲水性，增加其溶解度和化学稳定性，影响其生物活性，有助于其在细胞内和生物体内的储存和转运等。糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,E.C.2.4.x.y)是负责催化生物体内糖基化反应的酶类，它们将活性糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体，形成糖苷键。其中的GT1家族，由于其C末端含有1个由44个氨基酸组成的保守序列，该保守序列被认为是糖基化过程中与UDP-糖的结合的区域，所以被称为PSPG-box，据此将GT1单独归类为一个尿苷二磷酸糖基依赖的转移酶超家族(UGTs)，其成员主要以UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，UDP-鼠李糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体。由于糖苷化产物具有潜在的药用价值以及对植物生命活动调节的重要性，现在已受到人们的广泛关注。因此鉴别出苹果黄酮醇糖苷生物合成相关的糖基转移酶，对于阐明苹果黄酮醇糖苷生物合成途径有重要意义，也可用于其他植物基于基因工程技术的黄酮醇组分改良，对提高食物中的黄酮醇含量，增加食物的保健功能，具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示的，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。本专利技术提供的一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，是从苹果果皮中分离获得，为一种尿苷二磷酸半乳糖依赖的黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因。本专利技术的另一个目的是提供所述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白在合成黄酮醇3-O-半乳糖苷中的应用。将上述黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因连接到pET-32a(+)载体的多克隆位点中构建获得重组质粒，命名为pET-32a(+)-MdUGT75B1。在大肠杆菌中表达pET-32a(+)-MdUGT75B1，得到MdUGT75B1重组蛋白，可将黄酮醇转化成黄酮醇3-O-半乳糖苷。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了苹果黄酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相关糖基转移酶MdUGT75B1基因的功能，在体外，MdUGT75B1重组蛋白可以高效地将槲皮素转化成槲皮素3-O-半乳糖苷。本专利技术还提供了含有MdUGT75B1基因的重组质粒，为通过生物工程方法大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷，本专利技术提供了一种能大量合成黄酮醇3-O-半乳糖苷的途径，进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。附图说明图1：光照处理实验中苹果果皮中槲皮素3-O-半乳糖苷含量检测和MdUGT75B1基因表达分析。图2：MdUGT75B1氨基酸序列比对结果；CsUGT78A15(KP682361)，F3GT(AAD55985)，VVGT6(AB499075)。图3：MdUGT75B1重组蛋白SDS-Page凝胶图。图4：重组蛋白MdUGT75B1对槲皮素体外酶活分析HPLC图谱。图5：黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶的催化流程图与化学结构式；以槲皮素为糖受体，UDP-半乳糖为糖供体，经MdUGT75B1催化生成槲皮素3-O-半乳糖苷。具体实施方式下面对本专利技术的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：一、材料1、苹果品种：红富士(MaluspumilaMill)，以果实为材料，开展了蓝光(BL)加UV-B处理。设置三个生物学重复，每个重复4个果实，取果实样品外果皮1mm厚的皮层组织，迅速用液氮冻透，然后放至-80℃冰箱中保存。2、pET-32a(+)载体：购于长沙优宝生物科技有限公司。3、大肠杆菌BL21(DE3)PlysS表达宿主菌株：购于上海普洛麦格生物产品有限公司。4、LB培养基：称取20gLBbroth(上海生工生物工程)，加入500mL超纯水溶解，用1M的KOH调pH至7.0，高压蒸汽灭菌15min。5、UDP-半乳糖溶液(10mg/mL)：称取10mgUDP-半乳糖，融于超纯水，定容至1mL，-20℃保存。6、氨苄青霉素母液(Amp+，500mM)：称取9.3mg氨苄青霉素钠Amp，溶于50mL灭菌超纯水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。7、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG(500mM)：称取5.95gIPTG，溶于灭菌超纯水，定容至50mL，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。8、蛋白纯化试剂盒：ClontechHisTALON试剂盒，购于Takara宝生物工程有限公司。9、Tris-HCl缓冲液(pH7.5，100mM)：称取1.1214gTris加水至90mL搅拌溶解均匀，加HCl调pH至7.5，补水定容至100mL。二、MdUGT75B1的基因表达和黄酮醇糖苷含量的检测1、利用CTAB法提取苹果果皮的RNA，按照PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(Takara)试剂说明书操作合成cDNA。2、以苹果MdActin为内参基因，序列如SEQ:NO.3所示，引物为SEQ:NO.4和SEQ:NO.5，MdUGT75B1基因的引物为SEQ:NO.6和SEQ:NO.7，进行实时定量PCR分析其基因表达。反应体系包括10μLSsofastEvaGreenSupermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μL，2μLcDNA，6μLH2O。反应程序为：95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，循环45次；95℃反应10s；溶解曲线65℃to95℃，每5s上升0.5℃；结束。所用仪器为Bio-RadCFX96实时荧光定量PCR仪，每次检测都包括以H2O作反应模版的阴性对照。3、苹果黄酮醇糖苷的含量检测，所有样品用磨样罐磨成粉末，称取0.1g样品粉末加入1mL50％甲醇水溶液中，超声30min，然后11000rpm离心15min，吸取上清液至新管中用于HP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄酮醇3‑O‑半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因，其特征在于，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶MdUGT75B1基因连接到pET-32a(+)...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鲜，解林峰，曹运琳，赵志康，邢梦云，张波，徐昌杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33