一个银杏萜内酯合成路径中的甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种银杏萜内酯合成路径中甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用。公开了所述基因的核苷酸序列和基因编码的蛋白质序列。组织表达分析显示银杏甲羟戊酸激酶基因在叶片中表达量最高，在开花器官中的表达量显著偏低。银杏甲羟戊酸激酶基因的酵母功能互补验证了银杏甲羟戊酸激酶基因编码的蛋白质具备甲羟戊酸激酶的酶活性，在萜内酯合成途径中行使催化功能。通过外源激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理银杏植株，银杏甲羟戊酸激酶基因的表达量与萜内酯的含量均有提高。本发明专利技术所述的银杏甲羟戊酸激酶基因在银杏萜内酯合成路径中与萜内酯含量呈正相关性，该基因的过表达可以提高银杏中萜内酯含量。

Mevalerate kinase gene and its encoded protein in the pathway of Ginkgo Terpene Lactones synthesis and its application

The invention discloses a mevalonate kinase gene, a coding protein and an application thereof in the synthesis path of ginkgolides. The nucleotide sequence of the gene and the protein sequence encoded by the gene are disclosed. Tissue expression analysis showed that the expression level of mevalonate kinase gene was the highest in leaves, but was significantly lower in flowering organs. The complementary yeast function of the ginkgo mevalonate kinase gene confirmed that the protein encoded by the ginkgo mevalonate kinase gene had the activity of mevalonate kinase and played a catalytic role in terpene lactone synthesis. Ginkgo biloba plants were treated with exogenous hormones methyl jasmonate and salicylic acid, and the expression of mevalonate kinase gene and the content of terpene lactone were increased. The ginkgo mevalonate kinase gene has a positive correlation with terpene lactone content in the synthesis path of Ginkgo Terpene lactone, and the over-expression of the gene can improve the terpene lactone content in Ginkgo biloba.

【技术实现步骤摘要】
一个银杏萜内酯合成路径中的甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及银杏萜内酯合成途径的甲羟戊酸激酶基因的分离克隆、功能验证及实际应用。
技术介绍
银杏(GinkgobilobaL.)又被称为公孙树，其历史可以追溯到2亿年前的石炭纪，是世界上最古老的孑遗植物。目前，银杏的药用价值受到越来越多的关注，研究发现，银杏萜内酯是治疗心脑血管疾病的重要药物成分。然而，自然条件生长的银杏叶片中萜内酯含量极低，传统方式获得的银杏萜内酯远不能满足市场的需求，因此需要通过新的途径提高银杏萜内酯含量。随着分子生物技术的发展，人们对银杏萜内酯合成路径及相关基因的研究也在逐步深入，众多学者多年来对银杏萜内酯成分、合成部位、生物合成路径及合成途径的关键基因开展了大量研究，这些研究结果均表明：通过对银杏萜内酯合成途径中关键基因进行遗传改良，利用基因工程技术有望提高银杏萜内酯含量。银杏萜内酯含有的血小板活化因子是目前最有效的血小板聚集诱导剂，该物质与许多疾病的发生、发展紧密相关，在治疗和预防心脑血管疾病如老年性痴呆、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等方面具有显著疗效。植物萜类物质的合成路径分为两种，分别为甲羟戊酸途径和2C-甲基4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径。如图1所示，甲羟戊酸途径主要在细胞质中进行，主要合成产物为倍半萜、三萜等；2C-甲基4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径主要在一些质体中进行，主要合成半萜、单萜、二萜及四萜等。也有报道称在一些物种中两种路径途径存在交换机制。甲羟戊酸激酶基因是催化甲羟戊酸转化成甲羟戊酸-5-磷酸的第四种酶，其经磷酸甲羟戊酸激酶催化产生甲羟戊酸-5-二磷酸酯的酶促反应。然后将甲羟戊酸-5-二磷酸酯转化成由甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶催化的异戊烯基二磷酸酯。自1994年Riou等首次从拟南芥中克隆出甲羟戊酸激酶基因以来，又陆续从三七、玉米、长春花、茶叶等多种植物中克隆获得甲羟戊酸激酶基因。Lluch等研究发现，拟南芥甲羟戊酸激酶基因在其根部和花序中表达较高，且甲羟戊酸激酶基因5'端序列-295～-194区域的调控元件影响甲羟戊酸激酶基因高表达。Schulte等将长春花甲羟戊酸激酶蛋白进行分离纯化，结果表明，甲羟戊酸激酶基因受代谢产物反馈抑制调节。作为萜内酯合成路径重要基因，银杏中尚无甲羟戊酸激酶基因的报道。
技术实现思路
本专利技术的目是提供一种银杏萜内酯合成途径中甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸激酶的编码基因、该基因的应用。本专利技术第一方面提供了银杏萜内酯合成途径中甲羟戊酸激酶基因，来源于银杏(GinkgobilobaL.)品种‘家佛手’，其cDNA序列中含有1188bp的最大开放阅读框，序列如SEQIDNO.1所示，编码SEQIDNO.2所示的396个氨基酸序列。本专利技术第二方面提供了一种表达载体，其含有上述银杏萜内酯合成路径中的银杏甲羟戊酸激酶基因。本专利技术所述的表达载体所述银杏萜内酯合成路径中的银杏甲羟戊酸激酶基因插入pYES2的多克隆位点所得，具体的，由选取的银杏甲羟戊酸激酶编码基因插入到pYES2载体的BamHI和EcoRI酶切位点间所得。本专利技术第三方面提供了一种工程菌，所述工程菌为含有所述银杏萜内酯合成路径中的银杏甲羟戊酸激酶基因的转基因酵母菌株。本专利技术的宿主菌是指将银杏甲羟戊酸激酶基因表达载体转入到甲羟戊酸激酶基因缺失型酵母YMR208W。本专利技术第四方面提供了所述银杏萜内酯合成路径中的甲羟戊酸激酶基因，在调控银杏萜内酯生物合成中的应用。本专利技术提出的茉莉酸甲酯和水杨酸提高银杏甲羟戊酸激酶基因表达水平和银杏萜内酯含量的方法，提供了一种证据表明银杏甲羟戊酸激酶基因表达水平与银杏萜内酯之间存在正相关性。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了在银杏萜内酯的合成途径中发挥着重要的调节功能的银杏甲羟戊酸激酶基因，是具有序列表SEQIDNO.1中所述的基因序列，其开放阅读框是1188bp，编码396个蛋白质。生物信息学分析发现银杏甲羟戊酸激酶蛋白与其植物的甲羟戊酸激酶蛋白有61％-63％的相似度。系统进化分析发现，甲羟戊酸激酶分为细菌、真菌、裸子植物和被子植物四大类，其中银杏甲羟戊酸激酶构成独立的裸子植物分支并早于被子植物的分支出现。组织表达分析显示银杏甲羟戊酸激酶基因在银杏叶、根和茎中表达量较高，其中叶片中表达量最高，银杏甲羟戊酸激酶基因在开花器官中的表达量显著偏低。银杏甲羟戊酸激酶基因的表达模式与已报道的萜类物质在银杏组织中的分布情况相符合，因此本文推测银杏甲羟戊酸激酶基因可能在银杏萜内酯的合成途径中发挥着重要的调节功能。银杏甲羟戊酸激酶基因的酵母功能互补验证了银杏甲羟戊酸激酶基因编码的蛋白质具备甲羟戊酸激酶的酶活性，在萜内酯合成途径中行使催化功能。通过外源激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理银杏植株，银杏甲羟戊酸激酶基因的表达量与萜内酯的含量均有提高。证明银杏甲羟戊酸激酶基因在银杏萜内酯合成路径中与萜内酯含量呈正相关性，银杏甲羟戊酸激酶基因的表达上调和银杏萜内酯在水杨酸和茉莉酸甲酯处理后含量增加，这意味着这些基因的转录可以使银杏萜内酯生物合成增强。萜类物质的含量相对水杨酸处理同样较高，推测银杏甲羟戊酸激酶基因在银杏萜类合成中具有重要的调控功能。本专利技术对于植物品种改良具有重要的现实意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1银杏甲羟戊酸激酶蛋白跨膜结构域分析。图2银杏甲羟戊酸激酶蛋白与同源甲羟戊酸激酶蛋白质的氨基酸序列比对的结果。图3银杏甲羟戊酸激酶蛋白质序列比对构建的系统发育进化树。图4银杏甲羟戊酸激酶基因原核表达载体的SDS-PAGE电泳检测图。图5银杏不同组织中银杏甲羟戊酸激酶基因的表达模式。图6银杏甲羟戊酸激酶基因的酵母功能互补验证图。图7植物激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理后银杏甲羟戊酸激酶基因的表达模式。图8植物激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理后银杏中萜内酯含量变化。图9银杏萜内酯和银杏甲羟戊酸激酶基因表达量之间的关系(N＝21)。具体实施方式下面结合具体实施案例，进一步阐述本专利技术。这些实施案例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。本专利技术的实施例中所用的试验材料如下：植物材料：银杏(GinkgobilobaL.)品种‘家佛手’；菌株：大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)大肠杆菌；表达载体：pMD19-T载体、载体pET32a、pYES2质粒。本专利技术的实施例中涉及到的引物序列如下：扩增银杏甲羟戊酸激酶基因的cDNA编码区的引物为：扩增-F：5’-ATATTGGGAGTTCAGAATGGTGC-3’扩增-R：5’-ACATTTATGAGCTTGAGCATTGGAA-3’实时荧光定量分析中涉及的银杏甲羟戊酸激酶基因的qRT-PCR引物为：定量-F：5’-GGCATTAGTTGCTGGAGTTTCTGAG-3’定量-R：5’-GG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个银杏萜内酯合成路径中的甲羟戊酸激酶基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如列表SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一个银杏萜内酯合成路径中的甲羟戊酸激酶基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如列表SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求书1所述的银杏萜内酯合成路径中的甲羟戊酸激酶基因，其特征在于：所述基因编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。3.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述银杏萜内酯合成路径中的银杏甲羟戊酸激酶基因。4.根据权利要求书3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：许锋，宋启玲，陈强文，程水源，廖咏玲，叶家保，周忠诚，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42