基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法技术

本发明专利技术提供一种基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，通过选用一维孔道的MOFs体系作为难以实现高效转染的免疫细胞的转染载体，通过MOFs材料的限域效应成功负载核酸分子，并成功对多种免疫细胞进行转染实验，相比于传统转染试剂具有更高的效率，更低的成本和更小的毒性，且对负载于其中的核酸分子有良好的保护作用，使其在血清中不会被分解，为普适性转染的MOFs材料设计提供了基础。

Nucleic acid transfection based on MOFs channel confinement effect

The present invention provides a method of nucleic acid transfection based on the limitation effect of MOFs channels. By choosing the MOFs system with one-dimensional channels as the transfection carrier which is difficult to achieve high-efficiency transfection, nucleic acid molecules are successfully loaded through the limitation effect of MOFs materials, and the transfection experiments of many kinds of immune cells are successfully carried out. Transfection reagents have higher efficiency, lower cost and less toxicity, and have a good protective effect on nucleic acid molecules loaded in them, so that they can not be decomposed in serum, which provides a basis for the design of universal transfected MOFs materials.

【技术实现步骤摘要】
基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法
本专利技术属于生物分子载体领域，尤其涉及一种利用MOFs负载核酸分子后对常规转染试剂难转染的免疫细胞进行高效转染的方法。
技术介绍
金属-有机框架材料[Metal-organicFrameworks，MOFs，又称金属有机框架，金属有机骨架材料，金属有机配合物或配位聚合物(coordinationpolymer)]是由无机金属离子或金属簇与有机配体连接而成的晶态多孔材料，兼具有机材料和无机材料共同的特性。自2012年Yaghi课题报道了一系列具有介孔结构的IRMOF-74。(H.Deng,S.Grunder,K.E.Cordova,C.Valente,H.Furukawa,M.Hmadeh,F.Gandara,A.C.Whalley,Z.Liu,S.Asahina,H.Kazumori,M.O’Keffe,O.Terasaki,J.F.Stoddart,O.M.Yaghi,Science.2012,336,1018)其孔径范围由1.4-9.8纳米连续精确调控，并能够成功负载绿色荧光蛋白大分子。大部分生物大分子的尺寸大小刚好介于以上的孔径范围内，MOFs可以对这些生物分子可以高效的负载并保护其活性，因此在蛋白质体外催化(Y.Chen,V.Lykourinou,C.Vetromile,T.Hoang,L.Ming,R.W.Larsen,S.Ma,J.Am.Chem.Soc.2012,134,13188)，药物分子释放(Z.Dong,Y.Sun,J.Chu,X.Zheng,H.Deng,J.Am.Chem.Soc.2017,139,14209)等领域受到广泛关注。MOF的巨大比表面积和丰富的结构多样性使其在客体分子负载，特别是生物分子的负载和释放方面具有重要的应用前景。目前负载生物分子的材料多数为直接包裹生物分子，没有很高的选择性，此外大多数材料依赖如光、热、pH等外界刺激或者利用材料本身降解实现对生物分子释放的控制研究。在转染方面，免疫细胞一直都是比较难实现高效转染的细胞，一般非病毒载体对免疫细胞转染效率都不高，无法实现精确的调控及改良。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于开发安全，稳定，高效的普适性细胞转染载体，利用MOFs结构的精确可控性，对MOFs的孔道进行延伸，使之与生物分子能够具有合适的相互作用形成限域效应，更够高效的，可逆的负载和释放生物分子。利用生物相容性好的配体大幅降低MOFs生物毒性，而稳定的MOFs体系则保证整个运输过程中对生物分子全方位的保护，并在进入细胞后通过与细胞质内靶标物质的相互作用释放出负载的生物分子。本专利技术的技术方案可以通过以下技术措施来实现：基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，包括如下步骤：(1)制备孔径和核酸匹配的MOFs材料；(2)在步骤(1)所得MOFs材料中负载核酸分子，得到对核酸分子有限域效应的MOFs材料；(3)将负载有核酸分子的MOFs材料用于免疫细胞转染实验。优选地，步骤(1)中制备MOFs材料的方法，包括以下步骤：(1a)将具有水杨酸结构的配体材料进行轴向的延伸，合成苯环数目为1～5的配体；(1b)将配体和镍盐溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入水，乙醇和三乙胺的混合溶液，室温反应一定时间即得到纳米级的MOFs材料；(1c)将制备的MOFs材料进行活化，得到低细胞毒性的纳米级MOFs材料。优选地，步骤(1a)中采用Suzuki偶联反应，利用钯催化剂，在氩气保护氛围中反应，通过柱层析的方式纯化产物，实现苯环的依次递增。优选地，步骤(1a)中的配体材料为2,5-二羟基对苯二甲酸。优选地，步骤(1b)中所用配体苯环数目为2或3。优选地，步骤(1b)中所述镍盐为六水硝酸镍。优选地，步骤(1b)中水，乙醇和三乙胺的体积比为9：9：1。优选地，步骤(1b)中镍盐与配体的摩尔比为(2.5～3)：1。优选地，可通过调节MOFs材料自身的孔径来筛选最有利于单链DNA转染的载体，所述的孔径范围在1.8-2.4纳米的MOFs材料具有优良的转染性能。优选地，步骤(2)中负载核酸的方法包括溶液浸泡法，将不同孔径的MOFs材料分别加入到含荧光标记的核酸分子的溶剂中，经搅拌、离心、洗涤得到负载荧光标记的核酸分子的MOFs材料。优选地，所述免疫细胞转染实验具体步骤为，负载荧光标记的核酸的MOFs材料分别与不同的免疫细胞进行孵育，然后检测进入细胞内的荧光进行评估。优选地，所述的免疫细胞包括小鼠的巨噬细胞(RAW264.7)、人体的巨噬细胞(THP-1)、初代小鼠的淋巴细胞(CD4+T和B细胞)。进一步优选地，所述细胞中，MOFs材料对四种免疫细胞：RAW264.7，THP-1，CD4+T和B细胞有良好的转染效率。优选地，步骤(3)得到负载有核酸分子的MOFs材料后，分别于不同的免疫细胞进行孵育，恒温37℃。本专利技术利用MOFs作为转染载体，可对单链DNA分子吸附精确调控，在二维的金属有机-框架材料内调控孔道对单链DNA分子的相互作用形成限域效应。由于一维孔道的延伸性，MOFs可以容纳线性的生物大分子。与当前依赖于改变官能团或者形成化学键的调控方式不同，通过孔径精确改变来调节相互作用的强弱具有更好的普适性和操作性，并最大程度的保留生物分子本身的多级结构不受影响。与当前依赖于外界刺激或自身降解而实现的药物释放不同在于本专利技术的生物分子可控释放且没有破坏材料结构。合成的纳米级MOF不仅对核酸分子有非常高的负载量，而且能够对负载于其中的核酸分子起到保护作用，使其在血清中不被分解。附图说明利用附图对本专利技术作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本专利技术的任何限制。图1是本专利技术MOFs材料不同条件下的稳定性测试，ssDNA：单链DNA，cDNA：互补链DNA；图2是本专利技术双荧光标记的核酸分子的荧光淬灭测试，从上至下为FAM，TAMRA；图3是两种MOFs材料对不同长度链的核酸分子的吸附实验，左侧为Ni-IRMOF-74-II，右侧为Ni-IRMOF-74-III；图4是本专利技术Ni-IRMOF-74系列对核酸分子的血清稳定性试验；图5是本专利技术纳米级MOFs对材料RAW264.7和THP-1细胞的转染流式图，PI为凋亡细胞的荧光，FITC为转染细胞内的单链DNA的荧光；图6是本专利技术纳米级MOFs材料对CD4+T和B细胞的转染流式图，PI为凋亡细胞的荧光，FITC为转染细胞内的单链DNA的荧光。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面将进一步阐述本专利技术的具体实施例。MOFs材料的制备：将2,5-二羟基对苯二甲酸采用Suzuki偶联反应延伸合成苯环数目为分别为2、3、4、5的配体，将配体与六水硝酸镍一起加入到N,N-二甲基甲酰胺中，再加入乙醇，水和三乙胺，经搅拌，溶剂交换，干燥，活化，得到Ni-IRMOF-74系列样品(分别记为Ni-IRMOF-74-II、Ni-IRMOF-74-Ⅲ、Ni-IRMOF-74-Ⅳ、Ni-IRMOF-74-Ⅴ)。核酸分子的负载：将所得的MOFs材料，加入到荧光标记的核酸溶液中，经过振荡，离心，洗涤，得到负载核酸分子的MOFs材料。所述的核酸分子可进一步拓展为双链DNA，单链RNA，双链RNA，多肽等生物大分子。细胞转染测试：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备孔径和核酸匹配的MOFs材料；(2)在步骤(1)所得MOFs材料中负载核酸分子，得到对核酸分子有限域效应的MOFs材料；(3)将负载有核酸分子的MOFs材料用于免疫细胞转染实验。

【技术特征摘要】
1.基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备孔径和核酸匹配的MOFs材料；(2)在步骤(1)所得MOFs材料中负载核酸分子，得到对核酸分子有限域效应的MOFs材料；(3)将负载有核酸分子的MOFs材料用于免疫细胞转染实验。2.根据权利要求1所述的基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，其特征在于，步骤(1)中制备MOFs材料的方法，包括以下步骤：(1a)将具有水杨酸结构的配体材料进行轴向的延伸，合成苯环数目为1～5的配体；(1b)将配体和镍盐溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入水，乙醇和三乙胺的混合溶液，室温反应一定时间即得到纳米级的MOFs材料；(1c)将制备的MOFs材料进行活化，得到低细胞毒性的纳米级MOFs材料。3.根据权利要求2所述的基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，其特征在于，步骤(1a)中采用Suzuki偶联反应，利用钯催化剂，在氩气保护氛围中反应，通过柱层析的方式纯化产物，实现苯环的依次递增。4.根据权利要求2所述的基于MOFs孔道限域效应的核酸转染方法，其特征在于，步骤(1a)中具有水杨酸结构的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓鹤翔，周翔，彭双，别秉霖，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42