一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测5‑羟基色氨酸含量的方法。该方法步骤包括：取待测液，滴加1％KOH乙醇溶液，使pH9～10；再加入0.5％2,6‑二溴苯醌氯亚胺乙醇溶液，充分振荡混合均匀，室温静置，于606nm波长下检测吸光度，根据标准曲线计算出待测液中5‑羟基色氨酸的浓度。利用该特异性显色反应，可以准确快速的检测固体粉末、提取液、发酵液中的5‑羟基色氨酸含量，适用范围广，且可以排除色氨酸及其他氨基酸、肽和蛋白质的干扰，具有良好的专一性、准确性和重现性。

A rapid method for the determination of 5- hydroxytryptophan

The invention relates to a method for rapidly detecting the content of 5 hydroxytryptophan. The method includes the following steps: take the solution, add 1%KOH ethanol solution, make pH9 ~ 10, and then add 0.5%2,6 dibromo dibromo quinone chloro imide ethanol solution, fully oscillate and mix uniformly at room temperature, detect the absorbance at room temperature at the wavelength of 606nm, and calculate the concentration of 5 hydroxyl tryptophan in the solution according to the standard curve. The specific color reaction can be used to detect the content of 5 hydroxyl tryptophan in solid powder, extract and fermentation broth accurately and quickly. The application range is wide, and the interference of tryptophan and other amino acids, peptides and proteins can be eliminated. It has good specificity, accuracy and reproducibility.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法
本专利技术涉及一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法，属于色氨酸检测

技术介绍
5-羟基色氨酸（5-hydroxytryptophan，5-HTP）是色氨酸代谢成5-羟色胺重要的中间体，可作为5-羟色胺的前体物质。它是一种重要的神经类药物，对睡眠的调节和抑郁症的治疗有一定的作用。5-羟色胺最早在血清中发现的，又叫做血清素，在大脑皮层质和神经突触上含量很高，也是一种抑制神经递质。Duke大学医学中心的分子生物学教授在动物实验中观察到，一种名为色氨酸羟化酶-2的特殊蛋白会影响小白鼠脑组织中5-羟色胺的正常含量，而后者对于机体的精神健康有着重要作用。在天然产生的5-HTP常被用作食品添加剂，它是从加纳籽纯化而来。目前已有多项临床数据显示它在减肥中的重要作用，并且这是一种天然营养素，不用担心副作用。5-HTP在人体中会制造出血清素，对于正常的神经重要物质和脑功能有帮助，血清素可以帮助睡眠，也可以有效地控制疼痛，因此，5-HTP也成功的被拿来当作治疗睡眠失调的药物。此外，5-HTP能帮助抑制食欲，它能使人体所摄入的碳水化合物更少能更快感受到饱足感。目前5-HTP的分析方法有分光光度法，纸色谱法，薄层色谱法，荧光分析法，高效液相色谱法，电化学分析法等。其含量的测定最常见有效的方法是高效液相色谱法，这种测定方法准确可行，缺点是操作比较复杂，时间长，费用高，在某些方面并不适用于大批量使用。现有分光光度法检测氨基酸的方法是茚三酮显色法，该法为氨基酸常用的检测方法，除了天冬酰胺、脯氨酸和羟基脯氨酸外，其余氨基酸或肽与茚三酮反应均生成紫蓝色，因此仅适用于纯品氨基酸的检测，无法对加纳籽提取物、化学合成粗产物、发酵液等复杂样品中的5-羟基色氨酸进行准确定性定量。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术的不足，提供一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法。该方法操作简单便捷，耗时少，费用低。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法，步骤包括：取待测液，滴加溶液B，使pH9～10；再加入溶液A，充分振荡混合均匀，室温静置，于606nm波长下检测吸光度，根据标准曲线计算出待测液中5-羟基色氨酸的浓度；所述溶液A为：摩尔浓度为0.5％的2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液；所述溶液B为：摩尔浓度为1％的KOH乙醇溶液；所述标准曲线的制备：分别取2、4、6、8、10mg/L浓度5-羟基色氨酸溶液5ml，加入KOH乙醇溶液调pH至9～10，充分振荡混合均匀，加入2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液，充分振荡混合均匀，室温静置，于606nm波长下检测吸光度，以5-羟基色氨酸浓度为横坐标，吸光度Abs为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。优选地，所述待测液是提取法生产5-羟基色氨酸的产物液、合成法生产5-羟基色氨酸的产物液，和5-羟基色氨酸微生物菌种的快速筛选的发酵液中的一种。优选地，加入所述溶液A的量为100-500μL。优选地，所述室温静置的时间为20min-40min。有益效果：利用该特异性显色反应，可以准确快速地检测固体粉末、提取液、发酵液中的5-羟基色氨酸含量，适用范围广，且可以排除色氨酸及其他氨基酸、肽和蛋白质的干扰，具有良好的专一性、准确性和重现性。本专利技术的方法尤其适用于培养基中确定产物是否含有5-羟基色氨酸，便于检测培养基或其他发酵液中的5-HTP。本专利技术操作简单便捷，耗时少，费用低。附图说明图1为本专利技术5-HTP标准曲线图；图2为本专利技术色氨酸、色氨酸+Gibbs、5-羟基色氨酸、5-羟基色氨酸+Gibbs、Gibbs5条全波长扫描曲线的比较图；图3为本专利技术KOH用量对显色的影响图；图4为本专利技术0.5％2,6-二溴苯醌氯亚胺乙醇溶液用量对显色的影响图；图5为本专利技术静置时间对显色的影响图。具体实施方式本专利技术提供一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法，取待测液5mL，加入1%KOH乙醇溶液0.1mL，使pH9～10，充分振荡混合均匀，再加入0.5%2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液0.2mL，充分振荡混合均匀，室温静置20min，于606nm波长下检测吸光度，根据标准曲线计算出溶液中5-羟基色氨酸的浓度；标准曲线的制备：分别取2、4、6、8、10mg/L浓度5-HTP溶液5mL，加入1%KOH乙醇溶液0.1mL，充分振荡混合均匀，加入0.5%2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液0.2mL，充分振荡混合均匀，室温静置20min，于606nm波长下检测吸光度，以5-羟基色氨酸浓度为横坐标，吸光度Abs为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程，如图1所示。本专利技术利用Gibbs试剂（溶液A：0.5%2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液；溶液B：1%KOH乙醇溶液）在5-HTP中的显色反应来快速检测发酵液中该物质的含量是十分重要的。本专利技术用Gibbs试剂作为显色剂（显深蓝色），本专利技术显色剂与其他氨基酸反应不影响5-羟基色氨酸的吸光度。色氨酸与Gibbs不会发生反应，且色氨酸本身吸光值不影响5-HTP的显色反应。具体的，如图2所示，5-HTP与Gibbs的显色反应与色氨酸、色氨酸+Gibbs、5-HTP、Gibbs的光谱图完全不重合，前者主要在400nm以前，而后者吸光度主要在400nm以后。因此5-HTP与Gibbs试剂的反应不受色氨酸的干扰。扫描Gibbs试剂后发现其在400nm到800nm之间几乎没有吸光度，故可以排除一定量Gibbs本身吸光度对实验的影响。本专利技术在试剂中，5-羟基色氨酸在碱性环境下与2,6-二溴苯醌氯亚胺反应形成不稳定的蓝色络合物，经过一定时间的反应转化成棕绿色较稳定物质。推测其反应式如下所示，一分子5-HTP与一分子Gibbs试剂反应，酚羟基对位碳原子特异性结合而显色。Gibbs试剂是用于检查酚羟基对位无取代基的化合物，而5-羟基色氨酸并非酚羟基对位无取代基的化合物，但本专利技术独创性的专利技术5-羟基色氨酸可以与Gibbs试剂发生特异性显色反应，色氨酸和其余氨基酸、肽、蛋白质均不发生反应。利用该特异性显色反应，可以准确快速地检测固体粉末、提取液、发酵液中的5-羟基色氨酸含量，适用范围广，且可以排除色氨酸及其他氨基酸、肽和蛋白质的干扰，具有良好的专一性、准确性和重现性。本专利技术的方法尤其适用于培养基中确定产物是否含有5-羟基色氨酸，便于检测培养基或其他发酵液中的5-HTP。操作简单便捷，耗时少，费用低。本专利技术检测波长为606nm是重要的，检测波长的确定：由吸光度曲线对比得出，在400nm~1000nm波长范围内干扰因素较少且吸收峰坡度较缓，在λ=606nm时出现峰值，所以最适检测波长为606nm。本专利技术pH9～10是重要的。取0.1g/L5-HTP溶液5mL分别加到8只试管中，分别加入50、100、200、300μL1%KOH乙醇溶液，加入200μL0.5%2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液，显色后用分光光度计进行全波长扫描。由图3可以看出1%KOH乙醇溶液用量在100μL时，反应吸光度最高，且远远高于加入200、300μL的吸光度。1%KOH乙醇溶液用量在100μL时对应反应体系的pH值在9到10之间，因此该显色反应必须在酸碱度9到10之间时才能得到更明显的效果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测5‑羟基色氨酸含量的方法，其特征在于，步骤包括：取待测液，滴加溶液B，使pH9～10；再加入溶液A，充分振荡混合均匀，室温静置，于606nm波长下检测吸光度，根据标准曲线计算出待测液中5‑羟基色氨酸的浓度；所述溶液A为：摩尔浓度为0.5％的2,6‑二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液；所述溶液B为：摩尔浓度为1％的KOH乙醇溶液；所述标准曲线的制备：分别取2、4、6、8、10 mg/L浓度5‑羟基色氨酸溶液5 ml，加入KOH乙醇溶液调pH至9～10，充分振荡混合均匀，加入2,6‑二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液，充分振荡混合均匀，室温静置，于606nm波长下检测吸光度，以5‑羟基色氨酸浓度为横坐标，吸光度Abs为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测5-羟基色氨酸含量的方法，其特征在于，步骤包括：取待测液，滴加溶液B，使pH9～10；再加入溶液A，充分振荡混合均匀，室温静置，于606nm波长下检测吸光度，根据标准曲线计算出待测液中5-羟基色氨酸的浓度；所述溶液A为：摩尔浓度为0.5％的2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液；所述溶液B为：摩尔浓度为1％的KOH乙醇溶液；所述标准曲线的制备：分别取2、4、6、8、10mg/L浓度5-羟基色氨酸溶液5ml，加入KOH乙醇溶液调pH至9～10，充分振荡混合均匀，加入2,6-二溴苯醌氯亚胺的乙醇溶液，充分振荡混合均匀，室温...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国忠，冯志彬，张兴晓，张建龙，朱洪伟，于馨，姜琳琳，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37