用于从植物材料获得富含小RNA的含水提取物的方法和源自该方法的提取物技术

本发明专利技术涉及用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法。本发明专利技术的特征在于其包括以下步骤，根据所述步骤：a)使植物材料与水接触；b)将乙二胺四乙酸(EDTA)四钠添加至a)中获得的10.5和11之间的pH的混合物中；c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；d)纯化c)中获得的混合物，以便除去植物材料并回收含水粗提取物；和e)检查pH并重新调节(如果必要)至6和8之间的值。本发明专利技术还涉及可以通过这种方法获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的植物材料的含水提取物，以及包含这种提取物的组合物，和其用于防治皮肤衰老迹象和用于改善皮肤的水合作用的美容用途。

Method for obtaining aqueous extract rich in small RNA from plant material and extract derived from this method

The present invention relates to a method for obtaining aqueous extracts from a plant material rich in a small RNA with a maximum length of 150 nucleotides. The present invention is characterized by the following steps in which plant materials are contacted with water according to the steps of a), b) a mixture of 10.5 and 11 of pH obtained in the a) is added to the pH of the ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) four sodium; c) then, the pH obtained in the B) is adjusted to the value between 6 and 8; d) the mixture obtained in C) is obtained. In order to remove plant materials and retrieve aqueous extract, and E, check pH and re regulate (if necessary) the value between 6 and 8. The invention also relates to an aqueous extract of plant material rich in a small RNA with the maximum length of 150 nucleotides, as well as a composition containing the extract, and a cosmetic use for preventing skin aging signs and improving the hydration of skin.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从植物材料获得富含小RNA的含水提取物的方法和源自该方法的提取物
本专利技术涉及从植物材料获得富含具有150个核苷酸(nt)的最大长度的小RNA(核糖核酸)的含水提取物的方法，源自这种方法的提取物以及包含此类提取物的组合物和它们的美容用途。
技术介绍
在实验室中并且因此小规模进行的用于提取核糖核酸(RNA，低分子量RNA)的常规方案必须在化学罩下进行，因为这些方法涉及使用有毒且不被认为是化妆品溶剂的溶剂诸如苯酚和氯仿(Zumbo,P.2014"Phenol-chloroformExtraction,"2014)。将这些溶剂添加至裂解细胞或非常精细压碎的植物或动物组织的水相中，或者直接添加至在液氮存在的情况下产生的压碎制备物中。将因此获得的溶液在4℃下以近似10,000g的高速离心，以产生两个良好分离的相，含有蛋白质的有机相和含有总RNA的水相，中间相含有DNA。然后必须仔细回收水相，以避免无意收集中间相和有机相。用异丙醇进行沉淀RNA的步骤。然后用乙醇洗涤总RNA沉淀。然后将总RNA重新溶解于水中，并且必须在非常低的温度(-20℃且甚至更好-80℃)下储存。为了仅获得低分子量RNA，可以使用含有纯化柱的试剂盒，诸如来自Sigma的试剂盒，mirPremierTMmicroRNA分离试剂盒。这些试剂盒可以仅在实验室测试规模上使用，因为所讨论的体积为约为1mL，因此不能适应于大规模的产品开发。另外，所有这些提取和纯化方案都无法使得可能获得纯化的核酸级分。该RNA或DNA或小RNA核酸级分将不含任何其他目标分子，诸如次级代谢物、维生素、糖、肽等，其可以对皮肤具有有益效果并因此具有美容益处。此外，例如，文献WO8403835是已知的，其描述了用于获得富含纯DNA的植物胚芽的含水提取物的方法。这种方法值得注意地使用在含有蔗糖、EDTA(0.05M)和氯化钠的pH9.5的缓冲提取溶液中压碎的小麦胚芽和/或大豆胚芽。过滤之后，将残余物在环境温度下在搅拌下重新悬浮于补充有阴离子去污剂的pH7.4的缓冲盐水Tris溶液中，随后在0℃下在搅拌下添加高氯酸钠，并添加氯仿和辛醇，然后在低温(4℃)和非常高的速度(25,000g)下离心。回收基本上含有DNA的水相，其具有少量RNA和氨基酸，可以有利地对其使RNA酶起作用。因此，该文献公开了使用非常大量的处理，包括用阴离子去污剂和不同溶剂(包括氯仿和辛醇，其可以在产物中留下毒性痕迹并且因此不能用于化妆品中)处理，获得特异性富含DNA的植物胚芽的含水提取物。文献FR2831168也是已知的，其描述了用于从植物材料(特别是具有高DNA或RNA含量的植物胚芽或种子)获得富含核酸(DNA和/或RNA)的提取物的方法。该方法在于在水性介质中在纤维素分解酶存在的情况下在9至13(在几分钟内向中性演变的pH(这些酶的作用的最佳pH))的起始pH下提取植物材料，然后分离植物材料以回收含水提取物，最后用蛋白酶处理提取物并分离不溶性物质以回收纯化的含水提取物。因此获得的冻干产物可以特别含有0.1-1重量％的DNA，0.2-1.5重量％的RNA，以及碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素B和脂质。具体而言，基于该文献中描述的数据，因此获得的冻干产物似乎含有1至10mg/L的DNA和10至75mg/L的RNA。
技术实现思路
考虑到上述情况，本专利技术提出要解决的问题是开发用于从植物材料获得特异性富含小RNA且不包含DNA的含水提取物的方法，其对于在工业规模上实施是容易和廉价的，不强制要求使用纤维素分解酶(纤维素酶、半纤维素酶)或DNA酶，提供良好产量的小RNA，并且不具有所提及的现有技术方法的缺点，诸如例如使用去污剂和潜在地有毒溶剂。因此获得的提取物可以直接用于化妆品中。因此，本专利技术的第一主题是用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法，其包括以下步骤：a)使植物材料与水接触；b)将乙二胺四乙酸四钠(EDTA)添加至a)中获得的混合物中，所述混合物的pH在10.5和11之间；c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；d)纯化c)中获得的混合物，以便除去植物材料并回收含水粗提取物；和e)对含水粗提取物进行至少一次的过滤以获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物，检查其pH，并且如果需要将其调整至6和8之间的值，优选6和6.5之间的值。此外，本专利技术的第二个主题是通过根据本专利技术的方法获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的植物材料的含水提取物，其中它包含相对于提取物的总重量，以重量计，5至60g/kg干燥提取物和10至1000mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的小RNA，并且不包含DNA。本专利技术的第三个主题是包含有效量的作为抗衰老活性剂的根据本专利技术的提取物和生理学上可接受的介质的组合物。本专利技术的第四个主题是根据本专利技术的组合物用于防治皮肤衰老迹象的美容用途。最后，本专利技术的第五个主题是根据本专利技术的组合物用于改善皮肤水合作用的美容用途。附图说明在阅读参考附图撰写的说明书和以下非限制性实施方案后，将更好地理解本专利技术和由此得到的优点，在附图中：-图1A表示2％的琼脂糖凝胶上的电泳，其表明pH对根据本专利技术的实施例2(稻胚芽)的提取物中的低分子量RNA的提取的影响；-图1B表示2％的琼脂糖凝胶上的电泳，其表明酶促水解对根据本专利技术的实施例2(稻胚芽)的提取物中的低分子量RNA的提取的影响；-图2表示用定量根据本专利技术的实施例3(小扁豆)的提取物的低分子量RNA；-图3表示在用DNA酶处理之前和之后用定量根据本专利技术的实施例4(小扁豆)的提取物的低分子量RNA；-图4A表示根据实施例7、8和9的不同猴面包树(Adansionadigitata)的提取物对第8代(P8)人成纤维细胞上的透明质酸合酶2(HAS2)的表达的影响；和-图4B表示根据实施例7、8和9的不同猴面包树(Adansionadigitata)的提取物对第32代(P32)人成纤维细胞上的透明质酸合酶2(HAS2)的表达的影响。具体实施方式除非另有说明，否则在本说明书中应该理解，当给出间隔时，它包括所述间隔的上限和下限。本专利技术涉及经实施用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法。应该注意的是，本专利技术的方法可以在本领域技术人员已知的任何类型的初步提取步骤(化学水解，酶水解...)之后进行，使得可能例如预先消除对本专利技术的方法的正确运行可能有害的某些植物级分。“小RNA”或“低分子量RNA”被理解为意指具有低分子量且具有150个核苷酸的最大长度的非编码RNA(核糖核酸)，诸如所有单链和/或双链非信使小RNA，例如，微RNA、干扰RNA、内含子、小核RNA或任何RNA片段。通常，植物材料是植物，是植物界的活有机体，其特征在非常低的运动性，其以矿物质为食并吸收二氧化碳，包括其生命周期通常发生在水生环境中的植物，诸如藻类。有利地，为了实施该方法，根据本专利技术的植物材料是全植物或优选植物部分(果实、叶、根、鳞茎、胚芽、种子…)，其可以以新鲜、干燥、发芽、完整、粉末状、冷冻的形式使用，但也可以以转化后获得的植物残渣(诸如油饼或糟)的形式使用。为了实现这一点，可以使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法，其包括以下步骤：a)使植物材料与水接触；b)在pH为10.5和11之间，将乙二胺四乙酸(EDTA)四钠添加至a)中获得的混合物中；c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；d)纯化c)中获得的混合物，以便除去残余固体植物材料并获得纯化的含水粗提取物；和e)检查pH并如果必要重新调节至6和8之间、优选6和6.5之间的值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.17 FR 15023611.用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法，其包括以下步骤：a)使植物材料与水接触；b)在pH为10.5和11之间，将乙二胺四乙酸(EDTA)四钠添加至a)中获得的混合物中；c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；d)纯化c)中获得的混合物，以便除去残余固体植物材料并获得纯化的含水粗提取物；和e)检查pH并如果必要重新调节至6和8之间、优选6和6.5之间的值。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，使植物材料与水以4至20％(重量/重量)的植物材料/水比率接触。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中用乙二胺四乙酸(EDTA)四钠处理的步骤b)在搅拌下在20至80℃的温度下进行至少1小时的时间。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，将c)中获得的混合物离心。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在进行步骤e)之前对在d)中获得的含水粗提取物进行至少一次过滤，并且优选为通过将过滤截止值从20-50μm降低至0.1-0.30μm来依次过滤含水粗提物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中其包括在步骤c)之前直接对b)中获得的混合物，或者对b)中获得的混合物的离心之后的上清液进行额外水解步骤，并且通过选自碳水化合物酶、纤维素酶和/或蛋白酶的至少一种酶在45至65℃的温度下且在6至8.5的pH下作用至少1小时来除去植物材料。7.根据权利要求6所述的方法，其中其包括在65至80℃的温度下使酶失活至少1小时的步骤，该失活步骤直接在水解步骤之后或在步骤e)之前的2个依次过滤步骤之间进行。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d)之前将浓度为10至20g/kg的硅藻土或二氧化硅添加至所述混合物中。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中EDTA四钠的浓度为2和15mM之间，优选为10mM。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)中与水接触之前，将植物材料压碎。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物材料是选自种子、果实、鳞茎、花、叶、根、胚芽或选自油饼和糟的植物部分。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物材料选自西番莲科(Passifloraceae)、锦葵科(Malvaceae)、石榴科(Punicaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、金丝桃科(Clusiaceae)、番木瓜科(Cari...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·波尔托兰，E·奥热，V·勒夸，
申请(专利权)人：ISP投资有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US