以CD20为靶点的特异性抗体、CAR-NK细胞及其制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一种以CD20为靶点的抗CD20抗体或其抗原结合片段，其包括VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链，所述VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链之间直接连接或通过连接肽连接。本发明专利技术提供以CD20为靶点的抗CD20抗体或其抗原结合片段，并以此所构建的Anti CD20 CAR‑NK细胞为单克隆细胞株培养并扩增所得，性状也稳定，可用于大规模生产制备。Anti CD20 CAR‑NK细胞以CD20分子为靶抗原，能够特异性地杀死或杀伤淋巴瘤细胞，可作为淋巴瘤类疾病的治疗药物，用于CD20分子高表达的肿瘤的治疗。

【技术实现步骤摘要】
以CD20为靶点的特异性抗体、CAR-NK细胞及其制备和应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及以CD20为靶点的特异性抗体，以CD20为靶点的CAR-NK细胞及其制备和应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，缩写CAR)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。CAR基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用，其主要以T-细胞为载体。CAR-T，全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或4-1BB等胞内元件在体外偶联为一个嵌合基因，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。以CD20为靶点开发的抗体药物Rituximab在复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤的治疗上取得了良好的疗效。目前大量的研究证明CD20可作为治疗B细胞淋巴瘤的的靶点用于CAR的构建。但制备CAR-T的T细胞只能来自患者自身，不能异体回输，导致其生产成本较高，不利于其大规模应用。自然杀伤(naturalkiller，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用NK细胞来治疗癌症是最新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种以CD20为靶点的抗CD20抗体或其抗原结合片段，以及能够表达该结构域的CAR-NK细胞及其制备和应用，该细胞性状稳定，可大批量生产和制备，且可进行异体回溯。本专利技术一方面提供一种以CD20为靶点的抗CD20抗体或其抗原结合片段，其包括VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链，所述VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链之间直接连接或通过连接肽连接。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链，所述VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链之间通过连接肽连接。示例性地，所述连接肽的序列为GGGGSGGGGSGGGGS。示例性地，所述VH1链的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的序列或其同源序列，和/或所述VL1链的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的序列或其同源序列，和/或所述VH2链的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的序列或其同源序列，和/或所述VL2链的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的序列或其同源序列。示例性地，所述同源序列与原序列的同源性为60％以上，例如，约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上等。本专利技术另一方面提供一核苷酸序列，其能够表达上述抗CD20抗体或其抗原结合片段。示例性地，所述VH1链的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的序列或其简并序列，和/或所述VL1链的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的序列或其简并序列，和/或所述VH2链的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的序列或其简并序列，和/或所述VL2链的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的序列或其简并序列。示例性地，所述同源序列与原序列的同源性为60％以上，例如，约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上等。示例性地，所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段，其结构包括：VH1-VL1-VH2-VL2，和/或VH1-VH2-VL2-VL1，和/或VH1-VL2-VL1-VH2，和/或VL1-VH1-VH2-VL2，和/或VL1-VH2-VH1-VL2，和/或VL1-VL2-VH1-VH2，和/或VH2-VH1-VL1-VL2，和/或VH2-VL1-VH1-VL2，和/或VH2-VL2-VH1-VL1，和/或VL2-VH1-VL1-VH2，和/或VL2-VL1-VH1-VH2，和/或VL2-VH2-VH1-VL1。在本专利技术提供的一个具体实施方式中，以CD20为靶点的抗CD20抗体或其抗原结合片段包括VH1链、VL1链、VH2链和VL2链。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述抗CD20抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示的序列或其同源序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述抗CD20抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的序列或其简并序列。本专利技术另一方面提供一种AntiCD20CAR-NK细胞，该细胞能够表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括上述抗CD20抗体或其抗原结合片段。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域和/或共刺激信号传导区。示例性地，所述的跨膜结构域选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗CD20抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链，所述VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链之间直接连接或通过连接肽连接。

【技术特征摘要】
1.抗CD20抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链，所述VH1链和/或VL1链和/或VH2链和/或VL2链之间直接连接或通过连接肽连接。2.如权利要求1所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段，其结构包括：VH1-VL1-VH2-VL2，和/或VH1-VH2-VL2-VL1，和/或VH1-VL2-VL1-VH2，和/或VL1-VH1-VH2-VL2，和/或VL1-VH2-VH1-VL2，和/或VL1-VL2-VH1-VH2，和/或VH2-VH1-VL1-VL2，和/或VH2-VL1-VH1-VL2，和/或VH2-VL2-VH1-VL1，和/或VL2-VH1-VL1-VH2，和/或VL2-VL1-VH1-VH2，和/或VL2-VH2-VH1-VL1。3.如权利要求1或2所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段，所述VH1链的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的序列或其同源序列，和/或所述VL1链的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的序列或其同源序列，和/或所述VH2链的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的序列或其同源序列，和/或所述VL2链的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的序列或其同源序列；优选地，所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示的序列或其同源序列。4.表达权利要求1-3中任一项所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其中所述VH1链的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的序列或其简并序列，和/或所述VL1链的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的序列或其简并序列，和/或所述VH2链的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的序列或其简并序列，和/或所述VL2链的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的序列或其简并序列；优选地，所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的序列或其简并序列。6.AntiCD20CAR-NK细胞，其能够表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括权利要求1-3中任一项所述的抗CD20抗体或其抗原结合片段，和/或权利要求4或5所表达的抗CD20抗体或其抗原结合片段。7.如权利要求6所述的AntiCD20CAR-NK细胞，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域和/或共刺激信号传导区；优选地，所述的跨膜结构域选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，所述的共刺激信号传导...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华顺，
申请(专利权)人：浙江阿思科力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32