一种内生真菌高效遗传体系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，包括(1)适用于齿梗孢霉的农杆菌转化法；(2)齿梗孢霉体内高表达系统；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)齿梗孢霉基因定向敲除系统。所述内生菌为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)。本发明专利技术所提供的内生真菌齿梗孢霉遗传体系，首次建立了齿梗孢霉体内高表达系统，筛选出四个与齿梗孢霉适配的强启动子。本发明专利技术可在激活隐性基因簇、化合物生物合成机制以及酶功能研究中的应用。本发明专利技术方法设计合理，与现有原生质体转化法相比，其成本低廉、操作简单、实验周期短、转化效率高，为齿梗孢霉的基因工程研究和遗传改造提供材料。

Construction method and application of an efficient genetic system for Endophytic Fungi

The present invention provides a method for constructing an efficient genetic system of endophytic fungi, including (1) Agrobacterium transformation for pedomerium; (2) high expression system in the body of pedomaria; (3) the fluorescence expression system of pedomaria sppora; (4) the gene directed knockout system of pedomaria sppora. The endophyte is Calcarisporium arbuscula. The present invention provides a genetic system of Endophytic Fungi of the endophyte. For the first time, a high expression system in the body of pedomaria sppora has been established, and four strong promoters suitable for pedomaria sppora are screened. The invention can be used in activating recessive gene clusters, biosynthesis mechanism and enzyme function research. Compared with the existing protoplast transformation method, the method has the advantages of low cost, simple operation, short experiment cycle and high conversion efficiency, which provides materials for genetic engineering research and genetic modification of pedomaria sppora.

【技术实现步骤摘要】
一种内生真菌高效遗传体系的构建方法及其应用
本专利技术属于生物领域的遗传方法，涉及一种内生真菌的遗传操作体系，尤其涉及一种高效遗传体系的构建方法及其应用。
技术介绍
丝状真菌是天然产物的重要来源，齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)是蘑菇内生丝状真菌，能生产线粒体F0F1-ATP合成酶抑制剂aurovertin系列化合物，包括aurovertinE，B(1)，D(2)等。研究发现，aurovertinB具有良好的抗乳腺癌活性，有望成为临床治疗乳腺癌的备选药物。aurovertins含有独特的2,6-二氧杂双环辛烷结构，该结构独特的生物合成途径已被解析。前期测序结果发现，齿梗孢霉中含68个天然产物生物合成基因簇，具有巨大的开发价值。然而，齿梗孢霉是一种非模式的内生丝状真菌，之前研究仅建立了基于原生质体转化的基因敲除体系，该方法操作周期长，成本高，步骤繁琐，限制了对其进一步的研究开发。丝状真菌遗传操作体系主要有原生质体转化法、电激转化法、醋酸锂转化法、农杆菌介导转化法、以及CRISPR-Cas9等。前三种方法因需制备原生质体实验周期长、成本高。尽管CRISPR-Cas9已成功运用于少数模式真菌，但农杆菌转化法凭其优越性仍是最主流的丝状真菌遗传操作方法。其基本原理是，农杆菌通过毒力因子将肿瘤诱发(Ti)质粒上的转移DNA(T-DNA)整合到宿主染色体上，造成宿主的突变。它具有以下优点：(1)受体材料广泛；(2)转化效率高；(3)单拷贝转化比例高；(4)非同源的T-DNA转化可导致随机突变,同源的T-DNA转化时发生定向突变。此前齿梗孢霉未建立基于农杆菌介导的高效遗传体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，是一种新的齿梗孢霉遗传体系，该体系能对齿梗孢霉进行高效遗传改造。本专利技术所提供的一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，所述内生菌为齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula，ATCC46034，购自每个ATCC)通过以下步骤实现：(1)农杆菌转化方法；(2)齿梗孢霉高表达系统的建立；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)定向基因敲除系统的建立。其中步骤(1)农杆菌转化方法主要包括如下步骤：(a)重组农杆菌菌液制备；(b)真菌孢子悬浮液制备；(c)农杆菌与真菌孢子共培养；(d)转化子培养；(e)转化子筛选。(a)重组农杆菌菌液制备：将重组质粒电转化入根癌农杆菌EHA105，涂布于含50μg/mL卡那霉素LB固体培养基上，单菌落长出后进行PCR鉴定，将正确的重组农杆菌扩大培养并收集菌体，用含400μM乙酰丁香酮(AS)的液体诱导培养基(IM)重悬菌体至OD600约0.1，继续培养至OD600达到约0.8；其中重组农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105，购自上海唯地生物技术有限公司。(b)真菌孢子悬浮液制备：用含1‰吐温20的无菌水冲洗马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)真菌菌丝，过滤收集分生孢子，用IM稀释孢子浓度至107个/mL；(c)农杆菌与真菌孢子共培养：取步骤(a)100μL农杆菌菌液与步骤(b)100μL真菌孢子悬浮液混合均匀，涂布于含400μM铺有玻璃纸的固体IM表面，25℃培养48h；(d)转化子培养：将步骤(c)玻璃纸平移至含300μg/mL孢噻肟钠和100μg/mL遗传霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，25℃倒置培养7天至转化子出现；(e)转化子筛选：将步骤(d)的转化子通过菌落颜色筛选法、PCR验证、蛋白提取验证、代谢产物鉴定确定基因型。所述步骤(a)重组农杆菌菌液应培养至OD600约0.8，AS浓度应为400μM。所述步骤(b)中真菌孢子悬浮液浓度应为107个/mL。所述步骤(c)中AS浓度应为400μM，共培养温度为25℃，共培养时间为48h；步骤(2)齿梗孢霉的高效高表达系统，是通过高表达启动子与目的基因连接，再连上抗性基因标记形成高表达质粒，通过农杆菌转化法将质粒倒入齿梗孢霉体内。在齿梗孢霉体内表达水平高的启动子为：aurAp、gpdAp、tef1p、tubCp。抗性基因为遗传霉素抗性基因。步骤(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统，是通过高表达启动子与荧光蛋白基因连接，再连上抗性基因标记形成荧光表达质粒，通过农杆菌转化法将质粒倒入齿梗孢霉体内。荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。步骤(4)齿梗孢霉的高效基因定向敲除系统，是通过克隆目的基因上下游1200～1500bp序列作为同源臂，中间插入抗性基因行成定向敲除质粒，通过农杆菌转化法将质粒倒入齿梗孢霉体内。抗性基因为遗传霉素抗性基因。本专利技术的另一个目的是提供构建的内生真菌齿梗孢霉高效遗传体系在激活隐性基因簇、化合物生物合成机制以及酶功能研究中的应用。本专利技术所提供的内生真菌齿梗孢霉遗传体系，首次建立了齿梗孢霉体内高表达系统，筛选出四个与齿梗孢霉适配的强启动子；且与现有原生质体转化法相比，其成本低廉、操作简单、实验周期短、转化效率高，为齿梗孢霉的基因工程研究和遗传改造提供材料。附图说明图1为齿梗孢霉对遗传霉素的耐受性试验结果。图2为齿梗孢霉基于农杆菌转化法的建立遗传体系及条件优化；其中，图2A：当农杆菌浓度为0D600＝0.6、乙酰丁香酮浓度为200μg/mL时，不同的真菌孢子浓度对转化效率的影响；图2B：当真菌孢子浓度为107个/mL、乙酰丁香酮浓度为200μg/mL，不同的农杆菌浓度对转化效率的影响；图2C：当农杆菌浓度为0D600＝0.8、真菌孢子浓度为107个/mL，不同的乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响。图3为齿梗孢霉体内高表达载体示意图，图中promoter＝aurAp、tef1p、tubCp、gpdAp。图4为齿梗孢霉高表达菌株代谢产物HPLC检测结果。图5为齿梗孢霉高表达菌株蛋白表达检测结果，其中，图5A：高表达菌株体内总蛋白SDS-PAGE；图5B：高表达菌株体内总蛋白westernblot检测AurC；其中，泳道1-7代表的菌株与图4中i-vii菌株对应，泳道M：marker。图6为齿梗孢霉野生型菌株和红色荧光蛋白表达菌株在荧光显微镜下的形态，图中标尺代表长度为10μm，DIC代表微分干涉相衬，RFP代表红色荧光蛋白，DAPI代表4',6-二脒基-2-苯基吲哚。图7为齿梗孢霉体内基因定向敲除载体示意图。图8为基因定向敲除转化子PCR验证结果。图9为齿梗孢霉基因定向敲除菌株代谢产物HPLC检测结果。具体实施方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1：齿梗孢霉遗传体系的建立一、齿梗孢霉对抗生素的敏感性试验将齿梗孢霉野生型孢子均匀涂布于含有不同浓度遗传霉素的PDA培养基上25℃培养7天，分别设置遗传霉素浓度为0，25，50，100，150，200μg/mL，测试齿梗孢霉对遗传霉素的耐受性。结果发现(见附图1)：当遗传霉素浓度达到100μg/mL时，齿梗孢霉完全无法生长。因此，本实验选择100μg/mL遗传霉素作为筛选压力。二、齿梗孢霉农杆菌转化法1.质粒构建质粒pFGL815N(购自addgene)含有T-DNA，是农杆菌转化中的常用载体。用引物1+2(见表1)构巢曲霉(Aspergillusnidulans)gpdA启动子(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，所述内生真菌是齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)农杆菌转化方法；(2)齿梗孢霉高表达系统的建立；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)定向基因敲除系统的建立。

【技术特征摘要】
1.一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，所述内生真菌是齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)农杆菌转化方法；(2)齿梗孢霉高表达系统的建立；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)定向基因敲除系统的建立。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述农杆菌转化方法主要包括如下步骤：(a)重组农杆菌菌液制备：将重组质粒电转化入根癌农杆菌EHA105，涂布于含50μg/mL卡那霉素LB固体培养基上，将经PCR鉴定正确的重组农杆菌扩大培养并收集菌体，用含400μM乙酰丁香酮的液体诱导培养基重悬菌体至OD6000.1，继续培养至OD600达到0.8；(b)真菌孢子悬浮液制备：用含1‰吐温20的无菌水冲洗马铃薯葡萄糖琼脂培养基真菌菌丝，过滤收集分生孢子，用IM稀释孢子浓度至107个/mL；(c)农杆菌与真菌孢子共培养：取步骤(a)100μL农杆菌菌液与步骤(b)100μL真菌孢子悬浮液混合均匀，涂布于含400μM铺有玻璃纸的固体IM表面，25℃培养48h；(d)转化子培养：将步骤(c)玻璃纸平移至含300μg/mL孢噻肟钠和100μg/mL遗传霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃倒置培...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛旭明，李永泉，陈新爱，曹菲，程锦涛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33