一种工程化上皮细胞组织的制备方法技术

本发明专利技术属于组织工程学领域，公开了一种培养液添加剂、培养液以及保存液。本发明专利技术所述培养液包括细胞培养液和所述培养液的添加剂。本发明专利技术所述保存液可以4℃保存组织工程化上皮细胞片层，保存时间长达48小时。

【技术实现步骤摘要】
一种工程化上皮细胞组织的制备方法
本专利技术属于组织工程学领域，具体涉及一种工程化上皮细胞组织的制备方法，还涉及了培养液添加剂、培养液以及保存液。
技术介绍
人体组织损伤、缺损会导致功能障碍。传统的修复方法是自体组织移植术，虽然可以取得满意疗效，但它是以牺牲自体健康组织为代价的办法，会导致很多并发症及附加损伤；人的器官功能衰竭，采用药物治疗、暂时性替代疗法可挽救部分病人生命，但供体器官来源极为有限，因免疫排斥反应需长期使用免疫抑制剂，由此而带来的并发症有时是致命的。上世纪80年代，Lange提出了“组织工程学”这一新概念，从而为组织和器官的损伤修复提供新方法，弥补我国器官不足的困境，使组织器官损伤修复技术大大提高。组织工程学基本原理是以细胞生物学和材料科学相结合，在体外构建一个有生物活性的种植体，植入体内修复组织缺损，替代器官功能；或作为一种体外装置，暂时替代器官功能，达到提高生存质量，延长生命活动的目的。传统的组织工程学损伤修复方法一般分为两种方法：第一种方法是指将培养和扩增细胞或细胞团直接注射到损伤部位的方法，以期通过细胞的替代和修复恢复组织的正常结构和功能。第二种方法是将细胞种植在可降解生物支架上，利用可降解生物支架将细胞运送到组织损伤部位，伴随生物材料的降解过程使生长在其上的细胞发挥功能，修复受损的组织。而传统的组织工程学方法使得受损组织得到一定程度的修复，但是也带来了很多负面问题，如细胞不能很好的定植在受损组织部位；降解以后的生物支架材料会引起组织炎症等。组织工程细胞片层技术被视为新一代组织工程技术，弥补了传统组织工程技术的不足。组织工程细胞片层方法收获的结构更接近于天然组织结构，保留了细胞外基底蛋白和细胞表面的蛋白和受体。目前制备组织工程细胞片层的方法同样包括两种方法：第一种方法是利用中性蛋白酶制备法，中性蛋白酶是一种最温和的组织蛋白酶，它可以轻度分离细胞外基质，从而使细胞成膜片脱离。自从1980年RheinwaldGreen提出了用Dispase(中性蛋白酶)收获表皮细胞膜片之后，该方法以临床应用20多年，效果显著。目前有多种修复中度烧伤疾病的皮肤细胞片层在欧、美、日等国销售。第二种方法是基于温敏材料和外源基底物的细胞片层制备方法。在制备细胞片层过程中，通过处理外源基底物质，从而获得细胞片层结构。目前常用的外源基底物质主要是：羊膜、纤维蛋白胶和胶原等。2001年日本科学家专利技术了一种温敏材料培养皿，该材料在37℃时表面呈现疏水性，细胞能够贴壁生长；当温度低于32℃时，材料变成亲水性形成水化层，细胞片层可以从培养皿表面剥离。然而，上述制备组织工程细胞片层的方法存在许多问题。两种方法操作均较为复杂，需要专业人员操作，且成本较高。中性蛋白酶制备方法需要在外源蛋白酶的作用下才能收获细胞片层，虽然进行了多次洗涤，但制得的细胞片层中仍有外源消化酶的残留，影响制得的细胞片层的产品性能。而基于温敏材料和外源基底物制备方法需要在外源基底物或外源温敏材料的作用下才能收获细胞片层，制得的细胞片层的安全性及稳定性容易受到外源基底物和外源温敏材料的影响。此外由于温敏材料对温度敏感，温度的变化极易影响基于温敏材料和外源基底物的制备方法制得的细胞片层，造成细胞提前脱落。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种成本低、操作简单、无需外源基底物质和酶处理的组织工程化上皮细胞片层的制备方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种培养液的添加剂，包括抗氧化剂和糖蛋白。本专利技术所述培养液的添加剂中抗氧化剂对细胞的氧化损伤有保护作用，能够促进细胞的增殖。其中，所述抗氧化剂包括但不限于维生素C、维生素E。在一些实施方案中，所述抗氧化剂为维生素C和维生素E。本专利技术所述培养液的添加剂中糖蛋白包括但不限于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白。在一些实施方案中，所述糖蛋白为层粘连蛋白。更优选的，所述糖蛋白为层粘连蛋白-5。优选的，本专利技术所述培养液的添加剂中所述维生素C的终浓度为0.5μg/ml-100μg/ml，所述维生素E的终浓度为0.5μg/ml-55μg/ml；所述层粘连蛋白-5的终浓度为2ng/ml-100ng/ml。在一些实施方案中。本专利技术所述培养液的添加剂中所述维生素C的终浓度为10μg/ml，所述维生素E的终浓度为1μg/ml；所述层粘连蛋白-5的终浓度为10ng/ml。本专利技术所述培养液添加剂还可以添加到其它上皮细胞培养液中用于制备不同组织的组织工程化上皮细胞片层。如添加到口腔黏膜上皮细胞培养液中制备组织工程化口腔黏膜上皮细胞片层，添加到膀胱上皮细胞培养液中制备组织工程化膀胱上皮细胞片层，或添加到牙周上皮细胞培养液中制备组织工程化牙周上皮细胞片层。因此本专利技术还提供了所述培养液的添加剂在制备组织工程化上皮细胞片层中的应用。本专利技术还提供了一种培养液，包括细胞培养液和上述培养液的添加剂。其中所述细胞培养液为上皮细胞培养液，在一些实施方案中，所述细胞培养液为表皮细胞培养液，可用于培养皮肤上皮细胞，即表皮细胞。优选的，所述上皮细胞培养液为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、肾上腺素、表皮生长因子(EGF)、转铁蛋白、胎牛血清的DMEM/F12培养基。在一些实施方案中，所述上皮细胞培养液中氢化可的松的含量为0.4μg/ml、胰岛素的含量为0.12UI/ml、腺嘌呤的含量为48μg/ml、肾上腺素的含量为1μg/ml、表皮生长因子的含量为20ng/ml、转铁蛋白的含量为23μg/ml、胎牛血清的含量为1v/v％。根据上皮细胞的来源不同，所述细胞培养液可以为其它上皮来源的培养基，如口腔黏膜上皮细胞培养液、膀胱上皮细胞培养液、牙周上皮细胞培养液；还可以为间充质干细胞培养液、胚胎干细胞培养液、多潜能干细胞培养液，用于分化为不同种类的上皮细胞，进而培养获得不同种类的组织工程化上皮细胞片层。在一些实施方案中，所述细胞培养液为口腔黏膜上皮细胞培养液，可用于培养口腔黏膜上皮细胞。优选的，所述口腔黏膜上皮细胞培养液为含有氢化可的松、胰岛素、硒溶液、肾上腺素、表皮生长因子(EGF)、转铁蛋白、胎牛血清的DMEM/F12培养基。在一些具体实施例中，所述口腔黏膜上皮细胞培养液中氢化可的松的含量为0.4μg/ml、胰岛素的含量为0.12UI/ml、硒溶液的含量为50μg/ml、肾上腺素的含量为1μg/ml、表皮生长因子的含量为20ng/ml、转铁蛋白的含量为23μg/ml、胎牛血清的含量为1v/v％。本专利技术还提供了一种组织工程化上皮细胞片层的制备方法，获取上皮组织或上皮细胞，与上述培养液混合培养至细胞达到100％汇合，期间每两天更换一次所述培养液。优选的，所述培养为37℃，5％CO2培养箱培养。按照本专利技术，所述制备方法中所述上皮组织包括但不限于皮肤表皮组织、口腔黏膜上皮组织、膀胱上皮组织、角膜上皮组织或牙周上皮组织等成体上皮细胞。进一步的，所述组织工程化上皮细胞片层还可以由上皮细胞与上述培养液混合培养获得，其中所述上皮细胞包括但不限于组织分离、胚胎干细胞分化、间充质干细胞转分化、多潜能干细胞诱导分化或成体细胞转分化获得。在一些实施方案中，所述分离上皮组织的方法具体为：将皮肤组织浸泡于清洗液(DMEM+1％双抗)室温静置10min，然后将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养液的添加剂，包括抗氧化剂和糖蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种培养液的添加剂，包括抗氧化剂和糖蛋白。2.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述抗氧剂为维生素C和/或维生素E；所述糖蛋白为层粘连蛋白-5。3.根据权利要求2所述的添加剂，其特征在于，所述维生素C的终浓度为0.5μg/ml-100μg/ml，所述维生素E的终浓度为0.5μg/ml-55μg/ml；所述层粘连蛋白-5的终浓度为2ng/ml-100ng/ml。4.权利要求1-3任意一项所述培养液的添加剂在制备组织工程化上皮细胞片层中的应用。5.一种培养液，包括细胞培养液和权利要求1-3任意一项所述培养液的添加剂。6.根据权利要求5所述的培养液，其特征在于，所述细胞培养液为上皮细胞培养液、间充质干细胞培养液、胚胎干细胞培养液、多潜能干细胞培养液。7.根据权利要求6所述的培养液，其特征在于，所述上皮细胞培养液为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、肾上腺素、表皮生长因子、转铁蛋白、胎牛血清的DMEM/F12培养基。8.根据权利要求7所述的培养液，其特征在于，所述上皮细胞培养液中氢化可的松的含量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卓实，张明琦，王乐，
申请(专利权)人：何伟，
类型：发明
国别省市：辽宁,21