一种制备禽类睾丸间质细胞的方法技术

本发明专利技术属于细胞分离纯化领域；更具体地，本发明专利技术涉及一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，所述方法包括以下步骤：用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。本发明专利技术的制备禽类睾丸间质细胞的方法可以获得细胞量大且纯度高的睾丸间质细胞，操作过程简单规范，对细胞损伤较小，且有效地减少了细胞污染。

【技术实现步骤摘要】
一种制备禽类睾丸间质细胞的方法
本专利技术属于细胞分离纯化领域。更具体地，本专利技术涉及一种制备禽类睾丸间质细胞的方法。
技术介绍
睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)分布于睾丸曲细精管间隙中，是合成和分泌雄激素的主要场所。睾丸间质细胞分泌的睾酮占动物体内睾酮总量的96％左右。由于睾酮与靶器官受体结合后可发挥诸多重要的生理功能，所以睾丸间质细胞作为分泌睾酮最主要的细胞，其分离培养技术越来越受到人们的重视。因此，建立一套稳定高效便捷的睾丸间质细胞的原代细胞分离、培养和纯化的方法，对深入研究睾丸间质细胞相关功能具有重要意义。睾丸间质细胞的分离培养研究在哺乳动物诸如猪、羊等以及啮齿类动物大鼠、小鼠中较为常见，技术相对比较成熟，而在禽类的研究较少。目前禽类睾丸间质细胞分离方法基本与啮齿类动物相似，均采用Percoll连续密度梯度离心法分离收集睾丸间质细胞。本专利技术人前期也采用Percoll法在种公鸡中做了类似的预试验，结果表明，种公鸡的睾丸间质细胞主要集中在30～60％Percoll层中，但单只种公鸡的一对睾丸所获得的细胞在Percoll层中的量很少，且活率、纯度很低。综上，本领域亟需一种简单快速的制备禽类睾丸间质细胞的方法，该方法所获得的禽类睾丸间质细胞，不仅数量大，而且纯度高。建立这样的方法，可解决构建保持雄激素分泌活性的细胞模型，为研究种用家禽生殖生理的分子机制及睾丸间质细胞相关功能提供良好的试验平台。
技术实现思路
如上所述，在本领域中，对于哺乳动物睾丸间质细胞，已经开发出了成熟的分离和纯化技术，然而对于禽类睾丸间质细胞的分离和纯化，当前的方法所分离出来的睾丸间质细胞纯度不够高，并且也相对比较繁琐，不够简便、快捷。为解决上述问题，本专利技术人经过反复研究，开发出了一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，该方法不仅简便、快捷，而且所获得的睾丸间质细胞数量多、纯度高。因此，本专利技术提供了一种制备睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。本专利技术的方法与现有的家禽睾丸间质细胞分离培养方法相比，具有以下有益效果：目前，对睾丸生殖细胞的分离培养多以Percoll连续密度梯度离心法和胰蛋白酶消化法或二者结合为主，有文献报道采用Percoll梯度分离液分离家禽睾丸间质细胞，经离心后可得到较纯的睾丸间质细胞，但获得的细胞总量较少。本专利技术前期也做了类似的预试验，但结果表明，Pecoll梯度离心法费时费力，经长时间离心会导致大量细胞死亡。且家禽的睾丸间质细胞在Percoll层中数量极少，细胞纯度较低，单只公鸡获得的一对睾丸经分离培养获得的原代睾丸间质细胞无法满足试验需要，耗费试验材料。然而，通过采用本专利技术方法，可以使细胞活率达到96.08％，纯度达到97.73％。因此，本专利技术的方法为深入研究禽类睾丸间质细胞的相关功能提供良好的细胞工作平台。附图说明图1示出原代睾丸间质细胞的照片(100×)；图2示出第三代睾丸间质细胞的照片(100×)；图3示出3β-HSD染色后的第三代睾丸间质细胞的照片(100×)。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具体描述的实施方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本专利技术的保护范围进行限制。在不背离本专利技术的精神和宗旨的情况下，可以对本专利技术进行修改。本专利技术的保护范围由随附的权利要求来进行限定。如上所述，在本领域中，对于哺乳动物睾丸间质细胞，已经开发出了成熟的分离和纯化技术。然而，对于禽类睾丸间质细胞的分离和纯化，当前的方法所分离出来的睾丸间质细胞纯度不足够高，并且当前的方法也相对比较繁琐，不够简单、便捷。因此，本专利技术提供了一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。在本专利技术方法中，所谓禽类包括任何繁殖用雄性禽类，例如种公鸡、种公鸭、种公鹅、种公鸽、种公鹑等，但不限于此。在一个具体实施方案中，所述禽类是指种公鸡。任选地，在采用胶原酶对睾丸组织进行消化之前，即在进行步骤a)之前，需要对睾丸组织进行预处理，以使胶原酶消化更为顺利和彻底。具体地，在获得睾丸之后，需要首先去除睾丸白膜、血管以及可见的曲细精管；然后将睾丸切成细小碎块，例如1mm3的细小碎块。随后，需要采用胶原酶对睾丸组织进行消化，即进行步骤a)。在一个实施方案中，在步骤a)中使用的胶原酶可以是任何类型的适合消化睾丸组织的胶原酶，例如I型胶原酶、II型胶原酶、III型胶原酶和IV型胶原酶。在本专利技术中，优选地，采用II型胶原酶来消化睾丸组织。优选地，在对睾丸组织进行消化之前，将所述胶原酶温育一段时间，例如，在37℃温育30分钟，由此使得胶原酶能最好地发挥其消化功能。在一个实施方案中，所述胶原酶的浓度为0.8-1.2mg/mL；优选地，所述胶原酶的浓度为1mg/mL。在一个实施方案中，胶原酶消化液和睾丸组织之间的重量比为3:1至8:1。优选地，胶原酶液和睾丸组织之间的重量为5:1。在一个实施方案中，所述消化持续20-40分钟；优选地，所述消化持续25-30分钟。优选地，在消化结束之后、但在差速离心之前，可以对得到的细胞悬液进行过滤，例如通过使消化得到的细胞悬液过滤通过细胞筛，如200目(75μm)的细胞筛，由此将未去除的其他组织、或尚未被消化的睾丸组织、或消化后的细胞团块与经消化获得的单细胞悬液相分离，由此实现更好的睾丸间质细胞的分离。在通过上述方式获得细胞悬液之后，采用差速离心法来对该细胞悬液进行离心，由此分离出睾丸间质细胞。换言之，随后进行本专利技术方法的步骤b)。在一个实施方案中，所述差速离心法包括至少三次离心，其中第一次离心的离心速度为800-1200rpm，持续3-8分钟；并且第二次离心和第三次离心的离心速度为600-1000rpm，持续3-8分钟。在一个优选的实施方案中，所述第一次离心的离心速度为1000rpm，持续5分钟；并且第二次离心和第三次离心的离心速度为800rpm，持续5分钟。在一个进一步优选的实施方案中，所述差速离心法进一步包括第四次离心，并且第四次离心的离心速度为600-1000rpm，持续3-8分钟。更优选地，所述第四次离心的离心速度为800rpm，持续5分钟。任选地，在步骤b)中，在每次离心并弃去上清之后，额外地包括除去(例如通过移液器枪头除去)明显的血细胞沉淀。在通过上述的步骤b)获得睾丸间质细胞之后，继续通过差速贴壁法来对该细胞进行富集，即进行本专利技术方法的步骤c)。所述差速贴壁法包括至少三次细胞培养，其中第一次细胞培养持续24-48小时；第二次细胞培养和第三次细胞培养分别持续24-36小时。在一个优选的实施方案中，所述第一次细胞培养持续48小时，第二次细胞培养和第三次细胞培养分别持续24小时。任选地，在所述第三次细胞培养之后还可以进行进一步的后续细胞培养，以进一步富集睾丸间质细胞。所述后续细胞培养的培养时间同第二次细胞培养或第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备禽类睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：a)用胶原酶消化睾丸组织块以获得细胞悬液；b)通过差速离心法离心步骤a)获得的细胞悬液，由此分离获得睾丸间质细胞；c)通过差速贴壁法培养步骤b)获得的睾丸间质细胞，由此富集睾丸间质细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述禽类包括任何繁殖用雄性禽类，例如种公鸡、种公鸭、种公鹅、种公鸽、种公鹑。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，所述胶原酶为II型胶原酶，其浓度为0.8-1.2mg/mL，优选1mg/mL；并且消化时间为20-40分钟，优选25-30分钟。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤a)和步骤b)之间，还包括使用200目的细胞筛来过滤步骤a)中获得的细胞悬液。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述差速离心法包括至少三次离心，其中第一次离心的离心速度为800-1200rpm，优选1000rpm，持续3-8分钟，优选5分钟；并且第二次离心和第三次离心的离心速度为600-1000rpm，优选800rpm，持续3-8分钟，优选5分钟。6.根据权利要求5所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐晓龙，郭勇，陈余，尚明玉，陈晨，盛熙晖，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11