一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法及应用，重组工程菌用下述方法构建：(1)以合成的syndasR基因片段为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列为下游引物，扩增syndasR基因；(2)将syndasR基因以酶切连接的方式，连接到pIB139载体上，构建pZY1383载体；(3)将pZY1383载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02113。本发明专利技术的构建重组菌的方法提高了莫能菌素的产量，有利于降低莫能菌素的工业生产成本，提高经济效益。

Construction method and application of recombinant engineering bacteria for increasing monensin production

The invention discloses a method and application of a recombinant strain for improving the yield of mononycin. The recombinant strain is constructed by the following method: (1) the syndasR gene fragment of the synthesized SEQ is used as the template, the sequence shown as the upstream primer, the sequence of the SEQ ID No.2 is the downstream primers, and the syndasR gene is amplified; (2) s The yndasR gene was connected to the pIB139 vector to construct the pZY1383 vector, and (3) the pZY1383 vector was transformed into the Streptomyces cinnamomi, and the recombinant strain ST02113 was obtained to improve the yield of the mullensin. The method of constructing the recombinant bacteria improves the production of monensin, is beneficial to reducing the industrial production cost of monensin and improving the economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法及应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种提高莫能菌素产量的方法及应用。
技术介绍
莫能菌素是由肉桂地链霉菌产生的聚醚类抗生素，主要用作家禽的抗球虫剂及反刍动物的增重剂，近年来发现其对于前列腺癌、卵巢癌和直肠癌也有很好的抑制效果。目前工业上获得莫能菌素的方法主要是培养肉桂地链霉菌，收集发酵液并提纯其发酵产物。鉴于莫能菌素的重要应用和较高的经济价值，构建肉桂地链霉菌工程菌株，在工业生产中提高莫能菌素的产量具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前莫能菌素的生产现状，提供提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本专利技术的第二个目的是提供上述提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本专利技术的第三个目的是提供第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本专利技术的第四个目的是提供第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本专利技术的第五个目的是提供第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本专利技术的第六个目的是提供第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本专利技术的第七个目的是提供第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本专利技术的第八个目的是提供第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本专利技术的第九个目的是提供第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本专利技术的第十个目的是提供第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的syndasR基因片段为模板，以SEQIDNo.1所示序列为上游引物，以SEQIDNo.2所示序列为下游引物，扩增syndasR基因；(2)将syndasR基因以酶切连接的方式，连接到pIB139载体上，构建pZY1383载体；(3)将pZY1383载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02113。上述一种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonRI基因片段为模板，以SEQIDNo.3所示序列为上游引物，以SEQIDNo.4所示序列为下游引物，扩增synmonRI基因；(2)将synmonRI基因以酶切连接的方式，连接到pZY1383载体上，构建pZY1384载体；(3)将pZY1384载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02114。上述第二种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonRII基因片段为模板，以SEQIDNo.5所示序列为上游引物，以SEQIDNo.6所示序列为下游引物，扩增synmonRII基因；(2)将synmonRII基因以酶切连接的方式，连接到pZY1383载体上，构建pZY1385载体；(3)将pZY1385载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02115。上述第三种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonH基因片段为模板，以SEQIDNo.7所示序列为上游引物，以SEQIDNo.8所示序列为下游引物，扩增synmonH基因；(2)将synmonH基因以酶切连接的方式，连接到pZY1383载体上，构建pZY1386载体；(3)将pZY1386载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02116。上述第四种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonRII基因片段为模板，以SEQIDNo.5所示序列为上游引物，以SEQIDNo.6所示序列为下游引物，扩增synmonRII基因；以合成的synmonH基因片段为模板，以SEQIDNo.7所示序列为上游引物，以SEQIDNo.8所示序列为下游引物，扩增synmonH基因；(2)将synmonRII基因以酶切连接的方式，连接到pZY1384载体上，构建pZY1384RII载体；(3)将synmonH基因以酶切连接的方式，连接到pZY1384RII载体上，构建pZY1387载体；(4)将pZY1387载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02117。上述第五种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。本专利技术的技术效果：本专利技术的重组菌的构建方法提高了莫能菌素的产量，有利于降低莫能菌素的工业生产成本，提高经济效益。具体实施方式本专利技术各实施例所使用的肉桂地链霉菌来源于CGMCC7.240，感受态大肠杆菌为感受态DH5α。本专利技术使用的肉桂地链霉菌的保藏信息为：保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏时间：2017年10月10日。编号：CGMCC7.240。分类名称：肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamonensis)。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建和其发酵的方法，用下述方法构建和发酵：(1)以合成的syndasR基因片段为模板，设计如下引物：以SEQIDNo.1所示序列为上游引物，以SEQIDNo.2所示序列为下游引物，扩增syndasR基因；5’-GGAATTCCATATGGGCACCGAGGCCGG-3’(下划线处为NdeI酶切位点)；SEQIDNo.15’-GCTCTAGATCATCAGTCGGTCGGGCGCT-3’(下划线处分别为XbaI酶切位点)；SEQIDNo.250μLPCR反应体系为：10μL的5×buffer，5μLdNTPs，5μLDMSO，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL基因组模板，1μL聚合酶，余量用纯净水补齐。PCR参数如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃+∞。扩增得到syndasR基因片段。用DNA纯化试剂盒，回收PCR片段。(2)将syndasR基因以酶切连接的方式，连接到pIB139载体(WilkinsonCJ,Hughes-ThomasZA,MartinCJ,I,MironenkoT,DeaconM,WheatcroftM,WirtzG,StauntonJ,LeadlayPF(2002)Increasingtheefficiencyofheterologouspromotersinactinomycetes.JMolMicrobiolBiotechnol4(4):417-426)上，构建了pZY1383载体；50μL酶切体系为：5μL10×buffer，30μL质粒或基因片段，5μL限制性内切酶，余量用纯净水补齐。37℃反应30min。反应结束后，用DNA纯化试剂盒，回收酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，其特征在于用下述方法构建：(1)以合成的syndasR基因片段为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列为下游引物，扩增syndasR基因；(2)将syndasR基因以酶切连接的方式，连接到pIB139载体上，构建pZY1383载体；(3)将pZY1383载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02113；其中SEQ ID No.1：5’‑GGAATTC

【技术特征摘要】
1.一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，其特征在于用下述方法构建：(1)以合成的syndasR基因片段为模板，以SEQIDNo.1所示序列为上游引物，以SEQIDNo.2所示序列为下游引物，扩增syndasR基因；(2)将syndasR基因以酶切连接的方式，连接到pIB139载体上，构建pZY1383载体；(3)将pZY1383载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02113；其中SEQIDNo.1：5’-GGAATTCCATATGGGCACCGAGGCCGG-3’，下划线处为NdeI酶切位点；SEQIDNo.2：5’-GCTCTAGATCATCAGTCGGTCGGGCGCT-3’，下划线处为XbaI酶切位点。2.一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，其特征在于用下述方法构建：(1)以合成的synmonRI基因片段为模板，以SEQIDNo.3所示序列为上游引物，以SEQIDNo.4所示序列为下游引物，扩增synmonRI基因；(2)将synmonRI基因以酶切连接的方式，连接到pZY1383载体上，构建pZY1384载体；(3)将pZY1384载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST02114；其中SEQIDNo.3：5’-GGGAATTCCATATGCGCTACGAGATGCTGGG-3’，下划线处为NdeI酶切位点；SEQIDNo.4：5’-GGGAATTCCATATGTCATCAGCGGCCGGACAGG-3’，下划线处为NdeI酶切位点。3.一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，其特征在于用下述方法构建：(1)以合成的synmonRII基因片段为模板，以SEQIDNo.5所示序列为上游引物，以SEQIDNo.6所示序列为下游引物，扩增synmonRII基因；(2)将synmonRII基因以酶切连接的方式，连接到pZY1383载体上，构建pZY1385载体；(3)将pZY1385载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌ST0211...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广荣，周亮，丁琦，王海燕，
申请(专利权)人：天津大学前沿技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12