一种阿维链霉菌基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种能提高阿维菌素产量的基因工程菌，其是将阿维链霉菌中编码核糖体循环因子的ｆｒｒ基因通过表达载体引入阿维链霉菌中得到的核糖体循环因子过表达的重组菌。本发明专利技术的基因工程菌可直接用于阿维菌素的发酵生产，提高阿维菌素的发酵单位，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵及基因工程领域，具体涉及一种能提高 阿维菌素产量的基因工程菌及其构建方法与其在生产阿维菌素中的 应用。
技术介绍
阿维菌素是由阿维链霉菌(5^eptom;;ces "v^vw衍fc )发酵时产 生的一组高效杀虫的十六元环大环内酯类抗生素，它的天然产物共 有八个组分(Ala， Alb, A2a， A2b， Bla， Blb， B2a， B2b ),其中Bl组 分的杀虫活性最强，主要作为杀虫剂应用于农业生产上，几乎抗所 有与农业有关的线虫和节肢动物。阿维菌素的作用机理与常规化学 杀虫剂不同，它们并不抑制胆碱酯酶，也不抑制蛋白质的合成，而 是线虫及节肢动物类寄生虫的神经传导介质Y-氨基丁酸(GABA) 的激活剂，从而阻断线虫神经元之间、节肢动物神经末梢和肌细胞 间的神经冲动传导，使寄生虫麻痹致死。而哺乳动物外周神经传导 递质为乙酰胆碱，以GABA作传导递质的神经仅存在于中枢神经系 统，在正常使用的剂量下，由于哺乳动物的血脑屏障作用，导致药 物在中枢神经系统分布的浓度很低，不足以引起GABA的释放，所 以对哺乳动物的毒性很小，选择性极高。由于阿维菌素具有独特的 作用机制，不易使害虫产生抗性和交叉抗性，对作物极安全，不杀 伤天敌，有利于保持生态平衡，且易降解、无残留，对人、畜和环 境有高度安全性，使之成为了生物农药的奇葩，被我国农业部推荐 为无公害农药，具有非常广阔的巿场前景和应用价值。目前，阿维 菌素已在国内实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但我 国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。如何提高阿维菌素的产量，降低生产成本，是阿维菌素研究中一个 永恒的主题。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维 菌素的产量，具有重要的意义。核糖体循环因子(RRF, ribosome recyling factor)广泛存在于细菌 中，其功能是在蛋白合成过程中与负责转位的延伸因子(EF-G)协同 作用催化完成蛋白质合成的最后一步——翻译终止后核糖体复合物 的解体。此外，RRF还在肽链的延伸过程中维持了翻译的忠实性。 本专利技术尝试利用核糖体循环因子在阿维链霉菌中的过量表达来提高 阿维菌素的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种阿维链霉菌的基因工程菌，与其出发 菌株相比其阿维菌素的产量得到了提高。本专利技术的目的还在于提供 所述基因工程菌的构建方法。本专利技术的基因工程菌，是将阿维链霉菌中编码核糖体循环因子 的//r基因通过表达载体引入阿维链霉菌中得到的核糖体循环因子 过表达的重组菌。本专利技术为实现上述目的，提供一种构建上述工程菌的方法，其 首先将阿维链霉菌中编码核糖体循环因子的基因克隆到表达载 体中，再将该表达载体引入阿维链霉菌获得重组菌。所述表达载体可以是整合型表达载体或高拷贝质粒表达载体。具体可釆用如下方法构建工程菌，用PCR扩增阿维链霉菌中编 码核糖体循环因子(RRF)的，基因及其自身启动子，分别构建^r 基因的多拷贝或整合型表达质粒，并将构建好的重组质粒分别转化 到阿维链霉菌菌株中得到重组菌；或用PCR扩增阿维链霉菌中#r 基因的结构基因，将之置于红霉素抗性基因强启动子ermE*p之下， 分别构建^r基因的多拷贝或整合型表达质粒，将构建好的重组质粒 分别转化到阿维链霉菌菌株中得到重组菌。 用于构建^T基因表达载体的出发载体可为任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，如多拷贝质粒载体pKC1139、 pKC505、 pIJ653、 pIJ8154，或整合型质粒载体pSET152、 pIJ8600、 p脳60，优选为 pKC1139和pSET152。在本专利技术的一个实例中，以pKC1139为出发载体构建的A基 因表达载体为pFRl-1139(含#r基因及其自身启动子)和pFR4-1139 (>r基因置于红霉素抗性基因强启动子之下)；以pET 15 2 为出发载体构建的戶r基因表达载体为pFRl-152(含户r基因及其自 身启动子)和pFR4-152 (>r基因置于红霉素抗性基因强启动子 之下)。将^r基因表达载体转化阿维链霉菌的方法优选为PEG介导的 原生质体转化法，为提高转化效率，可先将表达载体转化到限制修 饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567中，从中提取质粒再转化阿维链霉 菌的原生质体；但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例 如电转化法、接合转移法等。用于构建重组菌的出发菌株可为任意一种阿维链霉菌的菌株， 优选为阿维菌素的高产菌株。本专利技术构建的重组阿维链霉菌基因工程菌可直接用于阿维菌素 的发酵生产，使阿维菌素的产量提高，从而降低生产成本。附图说明图1为含有^r基因及其自身启动子的重组质粒pFRl-1139 (图 1A)和pFRl-152 (图1B)的质粒图谱；图2为含有^r基因及红霉 素抗性基因强启动子的重组质粒pFR4-1139 (图2A)和pFR4-152 (图2B)的质粒图谱；图3为阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同转化子的阿 维菌素发酵单位；图4为阿维链霉菌GB-165及其不同转化子的阿维菌素发酵单位；图5为阿维链霉菌76-02-e及其不同转化子的阿维菌素发酵单位；图6为>r过表达菌株ATCC31267(pFRl-1139)与ATCC31267的阿维菌素发酵单位曲线图7为户r过表达菌株ATCC31267(pFRl-1139)与ATCC31267的菌体生长曲线。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术 的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。实施例1、 //r基因表达载体的构建一、含有^T基因及其自身启动子的重组质粒的构建1、含自身启动子的^r基因的扩增设计引物，用于PCR扩增位于阿维链霉菌染色体上含自身启动 子的^r基因，上游引物Primer Fl ( CCGACATGACCGCGATCAC )位于/〃起始密码子上游300 bp 处， 下游引 物 Primer Rl(CGO^rrCGTCATGCGCATCGTACGTGG,带下划线碱基为限制 性内切酶五coRI识别位点)位于#r终止密码子下游150 bp处，扩 增产物应为976 bp。以阿维链霉菌野生型菌株ACTT31267的总DNA为模板，Primer Fl和Primer Rl为引物，进行PCR扩增，扩增条件为95°C, 4 min; (95°C, lmin; 60°C, 1 min; 72°C， 1 min)x25个循环；72°C, lOmin。 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约lkb处有一条特异性的扩增条带。2、重组质粒pFRl-1139和pFRl-152的构建用DNA回收试剂盒回收PCR扩增产物，与T载体pMD18-T (TaKaRa公司)进行连接，经过测序比对表明，所扩增的片段确实 为含自身启动子的>r基因。将含有>r基因的T载体经5amHI和 M"dIII酶切，回收1008 bp的々r片段，将此片段连接到经万awHI 和历'"din酶切的pIJ2925载体(Janssen G R, an本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程菌，其是将阿维链霉菌中编码核糖体循环因子的ｆｒｒ基因通过表达载体引入阿维链霉菌中得到的核糖体循环因子过表达的重组菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：文莹，李丽莉，陈芝，宋渊，李季伦，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]