D‑对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法技术

本发明专利技术公开一种D‑对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法，包括以下步骤，步骤一、使用衍生化试剂和D‑对羟基苯甘氨酸在一定的反应温度及反应溶剂中进行衍生化反应，制备得到衍生化产品；步骤二、将所述衍生化产品使用正相高效液相色谱法进行分析，分离和检测衍生化的D‑对羟基苯甘氨酸及其对映异构体；所述的衍生化试剂选自二碳酸二叔丁酯、9‑氯甲酸笏甲酯、氯甲酸苄酯中的一种；所述高效液相色谱法是以正相色谱柱为分离柱。本发明专利技术的方法可有效分离D‑对羟基苯甘氨酸和其对映异构体衍生物，两者可实现基线分离，分离度大于1.5；基线平稳，峰型良好，专属性强，检测灵敏度高，有利于快速、准确地检测D‑对羟基苯甘氨酸中的对映异构体含量。

【技术实现步骤摘要】
D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法
本专利技术属于药物分析
，具体涉及一种D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法。
技术介绍
D-对羟基苯甘氨酸可用于β-内酰胺类半合成抗生素的生产，用其生产的主要药品有头孢氨苄、头孢拉定、头孢克洛、羟氨苄青霉素(阿莫西林)、头孢哌酮等，这些药物用途广泛，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、弓形体、螺旋体等均有杀灭作用，其抗菌能力已超过青霉素，在临床上的应用越来越广。D-对羟基苯甘氨酸还应用于感光领域和用作铁、磷、硅等的分析试剂等。因此，D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的化学、化工、医药中间体，同时也是合成手性药物的重要手性源。其化学名为D-4-hydroxyphenylglycine,其结构式如下：D-对羟基苯甘氨酸的对映异构体为L-对羟基苯甘氨酸，其结构式如下：通常在手性药物的制备和生产过程中，需要对其对映异构体的含量进行研究和控制，而合成手性化合物的手性源的对映异构体含量的研究和控制进一步保证了手性药物的光学纯度。因此制备高标准、高光学纯度的D-对羟基苯甘氨酸对于合成青霉素、头孢菌素等β-内酰胺类半合成抗生素及其他手性药物具有重要意义。目前常用于D-对羟基苯甘氨酸光学纯度分析的方法为旋光分析法，采用高效液相色谱法分离检测D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的文献报导较少。哈婧等将环糊精、羟丙基β-环糊精作为手性流动相添加剂，研究了D,L-对羟基苯甘氨酸在反相高效液相色谱系统中的拆分，建立了以β-环糊精为手性流动相添加剂分离对羟基苯甘氨酸对映异构体的方法，使用ODS柱(250mm×4.6mm)，以V(甲醇-β环糊精)：V(pH4.5磷酸盐缓冲液)＝30:70为流动相，流速0.2mL/min，柱温25℃，检测波长为230nm；但该方法仍存在一些缺点，在流动相中加入手性添加剂，添加剂消耗大，分析方法成本高，而且系统平衡时间较长。施俊庆等研究了8种商品手性色谱柱对D,L-对羟基苯甘氨酸的拆分，结果表明OD、AD、IA、AS、IB、(S,S)-whelk-O1和QN-AX7种手性色谱柱对D,L-对羟基苯甘氨酸均未能成功拆分，消旋对羟基苯甘氨酸仅在替考拉宁固定相ChirobitoticT柱上能够得到分离，但该色谱柱并非普通实验室常用色谱柱，而且该色谱柱价格昂贵，使用较少，限制了该方法的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种通过常规正相高效液相色谱法完成对D-对羟基苯甘氨酸中对映异构体进行分离检测的方法，可用于D-对羟基苯甘氨酸中对映异构体的定性、定量以及对映异构体过量率测定。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法，包括：步骤一、使用衍生化试剂和D-对羟基苯甘氨酸样品在一定的反应温度及反应溶剂中进行衍生化反应，制备得到衍生化产品；衍生化反应可保证样品中D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体均得到完全的衍生化；步骤二、将所述衍生化产品使用常规正相高效液相色谱法进行分析，分离和检测衍生化的D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体。其中，所述的步骤一中的衍生化反应可按照以下方法进行：将D-对羟基苯甘氨酸样品、衍生化试剂、碱以及反应试剂混合，在一定反应温度下搅拌反应；反应结束后，经后处理得到D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体衍生化产品。其中，所述的衍生化试剂选自二碳酸二叔丁酯、9-氯甲酸笏甲酯和氯甲酸苄酯中的一种，优选为二碳酸二叔丁酯。其中，所述的衍生化试剂和D-对羟基苯甘氨酸的摩尔比为n:1，其中1＜n≤10；优选为1＜n≤2；更优选为1.1≤n≤1.5；比如n为1.1、1.2、1.3、1.4或1.5等。其中，所述的碱选自二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、乙二胺、吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种；优选为三乙胺。其中，所述反应溶剂选自四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、水、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳中的一种或多种；优选为1,4-二氧六环和水的混合液。其中，所述的反应溶剂与D-对羟基苯甘氨酸的体积比可选择1～100:1；优选为3～50:1；更优选为5～10:1。其中，所述的反应温度可选择从0℃到所使用反应溶剂的常压沸点温度；优选为室温。具体的，所述的衍生化反应可按照以下方法进行：(1)在反应器中加入一定量的D-对羟基苯甘氨酸，溶解于反应溶剂中，缓慢加入衍生化试剂和碱，在一定反应温度下搅拌反应。(2)TLC跟踪至反应结束后，加入稀盐酸调节反应液pH至7，再加入乙酸乙酯萃取，减压浓缩除去乙酸乙酯，即得到D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体衍生化产品。衍生化反应后的D-对羟基苯甘氨酸产品含有衍生化的D-对羟基苯甘氨酸和衍生化的D-对羟基苯甘氨酸对映异构体，其分离检测方法为高效液相色谱法，所述高效液相色谱法的色谱条件是以正相色谱柱为分离柱。其中，所述的正相色谱柱可选择硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、或硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、或硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱，优选为硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱。其中，所述高效液相色谱法以低级烷烃、低级醇、有机酸混合液组成正相流动相系统；流速为0.6～1.5mL/min；检测波长为235nm～255nm；色谱柱柱温为15℃～45℃。其中，所述的低级烷烃选自C6-C8的烷烃；优选的，低级烷烃选自正己烷、正庚烷中的至少一种。其中，所述的低级醇选自C1-C4的一元醇；优选的，低级醇选自乙醇、异丙醇中的至少一种。其中，所述的正相流动相系统中低级醇占流动相的体积百分比可选择5％～50％；优选为10％-20％。其中，所述的正相流动相系统中有机酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸；优选为三氟乙酸。其中，所述的正相流动相系统中有机酸的浓度可选择0.05％～0.2％；优选为0.1％。其中，流速优选为0.8mL/min。其中，检测波长优选为245nm。其中，色谱柱柱温优选为25℃。其中，所述的高效液相色谱法，可按照以下方法进行：(1)取D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体衍生化产品，用乙醇溶解，配制成每1mL含D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体10-30mg的样品溶液；(2)设置流动相流速为0.8mL/min，检测波长为245nm，色谱柱柱温25℃；(3)取步骤(1)的样品溶液5μL注入色谱仪，记录色谱图。与现有技术相比，本专利技术所取得的有益效果如下：在现有技术中，D-对羟基苯甘氨酸的手性纯度分析使用旋光法测量，定量不准确。本专利技术给出了D-对羟基苯甘氨酸的衍生化方法，通过制备对羟基苯甘氨酸的衍生物，建立了衍生化后的D-对羟基苯甘氨酸的定性、定量和对映异构体过量率测定的高效液相色谱分析方法。该高效液相色谱分析方法是正相高效液相色谱法，可采用常规的正相色谱柱为分离柱，可有效分离D-对羟基苯甘氨酸和其对映异构体衍生物，两者可实现基线分离，分离度大于1.5。本专利技术的方法避免使用常规实验室罕见少用的或价格昂贵的色谱柱，避免添加大量手性试剂，分析检测成本低，可操作性强，不受色谱柱及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种D‑对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、使用衍生化试剂和D‑对羟基苯甘氨酸在一定的反应温度及反应溶剂中进行衍生化反应，制备得到衍生化产品；步骤二、将所述衍生化产品使用正相高效液相色谱法进行分析，分离和检测衍生化的D‑对羟基苯甘氨酸及其对映异构体；所述的衍生化试剂选自二碳酸二叔丁酯、9‑氯甲酸笏甲酯、氯甲酸苄酯中的一种；所述高效液相色谱法是以正相色谱柱为分离柱；所述正相色谱柱为硅胶表面共价键合有直链淀粉‑三(3,5‑二甲苯基氨基甲酸酯)、或硅胶表面共价键合有纤维素‑三(3,5‑二甲苯基氨基甲酸酯)、或硅胶表面共价键合有纤维素‑三(3,5‑二氯苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱。

【技术特征摘要】
1.一种D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体的分离检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、使用衍生化试剂和D-对羟基苯甘氨酸在一定的反应温度及反应溶剂中进行衍生化反应，制备得到衍生化产品；步骤二、将所述衍生化产品使用正相高效液相色谱法进行分析，分离和检测衍生化的D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体；所述的衍生化试剂选自二碳酸二叔丁酯、9-氯甲酸笏甲酯、氯甲酸苄酯中的一种；所述高效液相色谱法是以正相色谱柱为分离柱；所述正相色谱柱为硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、或硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、或硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤一中的衍生化反应按照以下方法进行：将D-对羟基苯甘氨酸、衍生化试剂、碱以及反应试剂混合，在一定反应温度下搅拌反应；反应结束后，经后处理得到D-对羟基苯甘氨酸及其对映异构体衍生化产品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的衍生化试剂和D-对羟基苯甘氨酸的摩尔比为n:1，其中1＜n≤10；优选为1＜n≤2；更优选为1.1≤n≤1.5。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的衍生化试剂为二碳酸二叔丁酯。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应溶剂选自下列溶剂中的一种或多种：四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、水、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳；优选为1,4-二氧六环和水的混合物。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应溶剂与D-对羟基苯甘氨酸的体积比为1～100:1；优选为3～50:1；更优选为5～10:1。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应温度从0℃到所使用反应溶剂的常压沸点温度；优选为室温。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的碱选自下列中的一种或多种：二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、乙二胺、...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡研，王亚妮，陈伊杰，蒋竞，赵初芒，
申请(专利权)人：常州合全新药研发有限公司，常州合全药业有限公司，无锡药明康德药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32