一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记KB2、引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与大白菜根肿病抗性基因

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记KB2、引物及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记KB2、引物及其应用。
技术介绍
大白菜（BrassicarapaL.ssp.pekinensis）属于十字花科芸薹属，是我国种植面积和产量最大的蔬菜作物之一。根肿病是由根肿菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin）引起的土传性疾病，可导致大白菜等十字花科植物的根部异常肿大，形成根瘤，是一种严重的世界性的十字花科植物根部病害，每年可导致全球十字花科蔬菜10%-15%的减产，在发病严重地区，甚至造成绝产，严重威胁十字花科蔬菜的生产。该病最早发现于欧洲，近年来，我国绝大多数省市自治区都有关于根肿病发生的报道，特别是在云南、湖北、辽宁、山东等地区，给我国大白菜等蔬菜的生产造成了巨大影响。虽然可以采取物理和化学等对根肿菌进行防治，但成本较高，且效果并不明显。培育抗根肿病的新品种，是防治大白菜根肿病最经济、最有效的措施。传统的抗根肿病育种中，每一代都需要采用田间接种病原菌进行性状鉴定的方法，费时费力，且容易受到环境因素的影响。分子标记辅助选择（Marker-assistedselection,MAS）技术为育种工作提供了有利工具，该技术是利用与目标基因连锁的分子标记，通过DNA水平的检测完成都目标性状的选择，提高选择效率，减少工作量，加快育种进程。利用Williams鉴别系统，对根肿菌的生理小种进行鉴定，发现4号生理小种是我国根肿菌的优势种，致病性强，危害最为严重。在大白菜不同染色体上，至少发现8个根肿病抗性基因或QTLs，其中，在大白菜A08染色体上，有一个抗根肿病基因Crr1a，对4号生理小种具有抗性。虽然有部分与该位点连锁的分子标记公布，但是其连锁性不够高，有一定的假阳性产生，或者检测时，抗病与感病材料差异不明显，结果容易混淆。开发合适的分子标记，用于大白菜抗根肿病品种或品系的选育，可以减少工作量，提高工作效率，降低育种成本，加快育种进程，具有很高的实际应用价值。
技术实现思路
对于大白菜抗根肿病品种或品系的选育，传统方法需要每代都在田间进行根肿菌接种鉴定抗病性，具有费时、费力易受环境影响等缺点，本专利技术提供了一种鉴定大白菜根肿病抗性的InDel分子标记、引物及其应用，利用该分子标记可以在大白菜苗期进行DNA水平的鉴定，从而大白菜克服传统育种中需要接种病原菌鉴定抗病性的缺点，简化大白菜抗根肿病品种或品系的培育过程。本专利技术提供了一种鉴别或者辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的InDel分子标记KB2，所述的分子标记单链DNA序列从5’端到3’端为：CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGGAACTCCCCTCTTCTATTGGTAACATGACTAATCTTGAGAATTTGAATCTTTCTGGATGCTCTAGCCTTGTGGAGCTCCCCTCTTCTATTAGTAATATGACTAATCTTGAGAATTTTAATCTCTCCCAATGCTCAAGCGTTGTACGGCTCTCTTTTTCTATTGGAAATATGACCAATCTCAAG本专利技术还提供了一种上述鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜的分子标记的特异性引物，其单链DNA序列从5’端到3’端为：上游引物F:CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGG下游引物R:ATTGAGATTGGTCATATTTCCAATA本专利技术可通过以下技术方案实现：提取待检测大白菜样品的基因组DNA作为模板，利用本专利技术的分子标记特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。具体步骤如下：1)利用CTAB法提取待测大白菜样品任意组织或器官的基因组DNA；2)以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记特异性引物对不同材料进行PCR扩增，获得扩增产物；3)利用琼脂糖凝胶电泳技术，对步骤2所得的PCR扩增产物进行电泳分离；4)利用凝胶成像系统，观察PCR扩增产物的位置；5)通过判断扩增产物的大小，扩增产物较大的为207bp的DNA片段，含有207bp扩增产物的待测样品含有抗根肿病基因Crr1a，为抗肝肿病大白菜材料；不含有207bp扩增产物的待测样品不含有抗根肿病基因Crr1a，为非抗根肿病大白菜材料。上述PCR扩增所用的分子标记特异性引物为如下（1）和（2）：（1）由序列表中序列2所示的单链DNA分子，或者将序列2删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。（2）由序列表中序列3所示的单链DNA分子，或者将序列3删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。本专利技术公开的一种与大白菜根肿病抗性基因Crr1a共分离的InDel分子标记KB2、引物与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：（1）通过对PCR扩增产物直接琼脂糖电泳检测，可以清晰地区分大白菜材料是否为抗根肿病大白菜材料，省时省力，不受环境因素影响。（2）本专利技术获得的分子标记及其特异性引物，在不同的大白菜甜瓜材料中可以对抗根肿病大白菜进行很好的区分，因此，本专利技术获得了一个可以高效、准确区分大白菜是否为抗根肿病大白菜材料的分子标记。（3）本专利技术方法特异性好，准确率可达到100%。（4）本专利技术通过对PCR产物直接琼脂糖电泳检测，比聚丙烯酰胺电泳检测简便快捷；比SNP分子标记的检测降低成本，是实用性很强的分子标记。表1本专利技术与现有技术优缺点比较附图说明图1为根肿病抗病材料与感病材料田间根肿病感病表型：其中G4表示根肿病感病材料，G6表示根肿病抗病材料；图2为本专利技术分子标记的特异性引物以抗根肿病材料G6、感根肿病材料G4及F2代分离群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增的电泳结果：其中M表示DNAMarker，其余泳道表示不同大白菜样品的PCR扩增产物的电泳结果，分别为1号：根肿病感病材料G4；2号：抗根肿病材料G6，其余样品为F2代分离群体材料。具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。以下实施例中的大白菜材料根肿病感病材料G4、抗根肿病材料G6和F1代材料，公众可从天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜课题组获得，该材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其他用途使用。实施例1大白菜根肿病抗病材料F2分离群体的获得以大白菜抗根肿病材料G6为母本，感病材料G4为父本，进行杂交获得F1代，F1代植株经田间抗病性鉴定，全部为抗病材料。F1代自交获得F2代分离群体，用于大白菜根肿病表型鉴定及分子标记检测。实施例2.大白菜F2代群体根肿病表型鉴定及分子标记检测一、F2群体大白菜根肿病抗性表型鉴定以实施例1获得的F2群体为材料，播种后接种根肿菌4号生理小种，接种和调查本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别或者辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的InDel分子标记KB2，其特征在于，所述的分子标记从5’端到3’端的单链DNA序列为：CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGGAACTCCCCTCTTCTATTGGTAACATGACTAATCTTGAGAATTTGAATCTTTCTGGATGCTCTAGCCTTGTGGAGCTCCCCTCTTCTATTAGTAATATGACTAATCTTGAGAATTTTAATCTCTCCCAATGCTCAAGCGTTGTACGGCTCTCTTTTTCTATTGGAAATATGACCAATCTCAAG。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别或者辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的InDel分子标记KB2，其特征在于，所述的分子标记从5’端到3’端的单链DNA序列为：CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGGAACTCCCCTCTTCTATTGGTAACATGACTAATCTTGAGAATTTGAATCTTTCTGGATGCTCTAGCCTTGTGGAGCTCCCCTCTTCTATTAGTAATATGACTAATCTTGAGAATTTTAATCTCTCCCAATGCTCAAGCGTTGTACGGCTCTCTTTTTCTATTGGAAATATGACCAATCTCAAG。2.一种用于权利要求1所述的鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜的分子标记的特异性引物，其5’端到3’端的单链DNA序列为：上游引物F:CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGG下游引物R:ATTGAGATTGGTCATATTTCCAATA。3.利用权利要求1所述的InDel分子标记KB2鉴定大白菜根肿病的方法，其特征为提取待检测大白菜样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2中所述的分子标记特异性引物进行聚合酶链式反应扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。4.权利要求3所述的鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜...

【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，张红，闻凤英，刘晓晖，温娟娟，华德平，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12