本发明专利技术公开了一种panD突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示，所述的panD突变基因SEQ ID No.1是panD基因的第34位碱基由A变成G；所述的panD突变基因SEQ ID No.3是panD基因的第50位碱基由T变成C。本发明专利技术还公开了包含上述突变基因的基因工程以及该基因工程菌在催化生产β‑丙氨酸中的应用。本发明专利技术包含panD突变基因的基因工程菌可以高效转化L‑天冬氨酸来生物法制备β‑丙氨酸，β‑丙氨酸的产量分别达42.81g/L和19.46g/L左右，比亲株分别提高了近4.8倍和2.2倍。
【技术实现步骤摘要】
一种panD突变基因、基因工程及其在催化生产β-丙氨酸中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种panD突变基因、基因工程及其在催化生产β-丙氨酸中的应用。
技术介绍
β-丙氨酸，别名：3-氨基丙酸(3-aminopropanoicacid)，又称为β-氨基丙酸，β-丝析氨酸，β-初油氨基酸，作为一种重要的化学品，广泛应用于化妆品、水处理、建筑、饲料、食品、医药等多个领域。如：可以作为铅中毒解毒剂。β-丙氨酸又是一种潜在平台化合物，通过化学反应，可衍生出多种重要的化学品，如：D-泛酸钙、尼龙-3、丙烯腈等。目前全球D-泛酸钙年产量6000-7000t，年需求量达上万吨，产品供不应求。医药工业中β-丙氨酸主要作为初始原料合成泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮、β-丙氨酸金属配合物。由于β-丙氨酸及其衍生物在美容、食品、医药、动植物饲料及化工等领域的广泛应用，市场需求量呈日渐上升趋势。L-天冬氨酸α-脱羧酶(ACD)能催化脱去L-天冬氨酸的位羧基，产生β-丙氨酸和二氧化碳。上世纪七八十年代，Nakano、Williamson等研究团队先后发现大肠杆菌能利用细胞内PanD合成β-丙氨酸，并对该酶的作用机理进行了研究。然而天然PanD的活性比较低，且直接从自然界中获得产酶活力高的菌株比较困难。1999年，德国Dusch等人首次将谷氨酸棒杆菌来源的panD基因分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。专利CN101210230A中将大肠杆菌中的L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶基因克隆并进行异源表达，但是合成β-丙氨酸的能力只达到2.94g/L，离真正应用还有很大距离。尽管panD基因的重组表达在一定程度上提高了其在生物法制备β-丙氨酸中的能力，但天然序列和结构的panD的重组表达量和活力目前还不够高，这限制了PanD在生物法制备β-丙氨酸中的应用。针对这个问题，国内外研究人员对panD基因进行了随机突变，以期研究panD序列与功能的关系，为提高panD的活力提供理论基础。Pei等以枯草的重组菌株为研究对象，采用随机突变的方式，得到的突变菌株的最高酶活是野生菌的50％。就目前而言β-丙氨酸合成的研究热点及难点：提高天冬氨酸脱羧酶的活性和产量。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种panD突变基因。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种具有较高天冬氨酸脱羧酶活性的基因工程菌。本专利技术最后要解决的技术问题是提供利用上述基因工程菌全细胞催化生产β-丙氨酸的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种panD突变基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示。其中，所述的panD突变基因SEQIDNo.1是panD基因的第34位碱基由A变成G；所述的panD突变基因SEQIDNo.3是panD基因的第50位碱基由T变成C。所述的panD基因来源于C.glutamicum(ATCC13032)中编码L-天冬氨酸-a-脱羧酶的panD基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。一种panD突变基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.4所示。一种重组质粒，包含了权利要求1所述的panD突变基因。一种基因工程菌，包含了所述的重组质粒。上述基因工程菌的构建方法，将panD突变基因克隆到pET-28a(+)表达载体上，得到重组质粒pET28a-panDC.g，将所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-pET28a-panDC.g。上述基因工程在催化生产β-丙氨酸中的应用也在本专利技术的保护范围之内。具体的应用方法是，将基因工程菌加入L-天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的pH值至7.0)和pH缓冲液，然后加入金属离子，20-60℃(优选37℃)，反应2-15小时(优选12小时)，制备β-丙氨酸。所述基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pET28a-panDC.g需要经过预培养，培养方法如下：I、从平板上分别挑取重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET28a-panDC.g的单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后转接到含有50mg/L卡那霉素抗性100mLLB培养基里，培养至OD600＝0.3-0.5，加入0.5mmol的IPTG，诱导10h，离心集菌，得到重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET28a-panDC.g的细胞。II、发酵培养：培养基配方：蛋白胨：10g/L，酵母粉：5g/L，氯化钠：5g/L，溶剂为水，将步骤I得到的细胞进行发酵培养，培养温度：35-38℃(优选37℃)，培养时间：10-15h(优选12h)。其中，参与催化生产β-丙氨酸反应的基因工程菌，其OD600值为1-50，优选为5。其中，L-天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为5-200g/L，优选100g/L。其中，所述的金属离子为Co2+，Fe2+，Mn2+，Ca2+中的一种或几种；优选Fe2+。所述金属离子在初始反应体系中的浓度为5-100mM，优选50mM。其中，所述的pH缓冲液是Mops缓冲液，初始母液的摩尔浓度为10-500mM，优选200mM。pH缓冲液的量没有特别要求，在加入L-天冬氨酸的水溶液之后，通过添加pH缓冲液的量控制菌株的OD值以及L-天冬氨酸的初始反应浓度。本专利技术所述panD突变基因是以包含了panD基因基因工程菌为亲株A进行易错PCR反应，随机突变改变L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)基因的密码子碱基，筛选出PanD酶活和β-Ala产量与亲株A相比明显提高的突变株。易错PCR随机突变改变panD基因的密码子碱基的位置，最终筛选获得突变株56，134号抽提质粒，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的panD基因序列，分别发现突变株56第34位碱基A变成G(SEQIDNO.1)，相应的氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸(SEQIDNO.2)；突变株134第50位碱基T变成C(SEQIDNO.3)，相应的氨基酸由缬氨酸变成丙氨酸(SEQIDNO.4)。有益效果：本专利技术相比于现有技术，具有如下优势：本专利技术比较了不同来源的panD基因对β-Ala产量的影响，确定以C.glutamicum(ATCC13032)中编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶的panD基因生产β-Ala产量最高；应用易错PCR技术对panD基因进行随机突变改造，获得活力最高的重组大肠杆菌56号和134号所产β-Ala的产量达42.81g/L，19.46g/L，而亲株A所产β-Ala的产量为8.84g/L左右，分别提高了4.8倍和2.2倍。应用易错PCR技术对panD基因进行随机突变改造，获得了的突变菌株β-丙氨酸产量明显提高的重组大肠杆菌，育种目标明确、效率高。附图说明图1为不同基因来源对生产β-丙氨酸的影响。图2突变菌株与重组菌株的酶活对比。图3是复筛后几个突变菌株生产β-丙氨酸的对比。图4是重组菌全细胞催化L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸的产量对比图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种panD突变基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种panD突变基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的panD突变基因，其特征在于，所述的panD突变基因SEQIDNo.1是panD基因的第34位碱基由A变成G；所述的panD突变基因SEQIDNo.3是panD基因的第50位碱基由T变成C。3.一种权利要求1所述的panD突变基因的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.4所示。4.一种重组质粒，其特征在于，包含了权利要求1所述的panD突变基因。5.一种基因工程菌，其特征在于，包含了权利要求4所述的重组质粒。6.权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将panD突变基因克隆到pET-28a(+)表达载体上，得到重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，李欢欢，王昕，卢媛媛，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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