寡褐藻胶裂解酶OalC6的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种外切型寡褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用。本发明专利技术从海洋细菌

Preparation and application of oligosaccharide lyase OalC6

The present invention discloses a kind of exotangent oligosaccharide lyase, its encoding gene and its application. The present invention is from marine bacteria

【技术实现步骤摘要】
寡褐藻胶裂解酶OalC6的制备方法与应用
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种寡褐藻胶裂解酶OalC6的制备方法及应用。具体地，本专利技术涉及一种利用重组大肠杆菌制备寡褐藻胶裂解酶OalC6的方法及其应用。
技术介绍
我国褐藻胶产量位居全球第一。褐藻胶是多种海藻的细胞壁成分，其基本组成单元为单糖，是由互为差向异构体的甘露糖醛酸（M）和古洛糖醛酸（G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。根据其结构特点，褐藻胶多糖可分为三种片段，由多聚甘露糖醛酸构成的PolyM片段、多聚古洛糖醛酸构成的PolyG片段和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸交替排列而成的PolyMG片段。褐藻胶是一种重要的海洋多糖类物质，为多种微生物提供能源物质。绝大多数的海洋细菌通过以下途径进行褐藻胶的利用：首先，细菌分泌至胞外的内切的褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶降解为小分子褐藻胶寡糖；褐藻胶寡糖通过细菌的细胞膜进入细菌体内，在外切的寡褐藻胶裂解酶作用下降解为单糖；单糖经非酶催化作用形成α-酮酸，然后进入ED（Entner-Doudoroff）途径或类似ED途径进一步利用，生成乙醇等。褐藻胶裂解酶根据其一级序列及三维结构的不同，在碳水化合物多糖裂解酶家族中被划分为7个不同的家族：PL-5、6、7、14、15、17和18（TanGetal.NucleicAcidsRes,2005,33:e122）。目前发现的褐藻胶裂解酶大多数为PL-5和PL-7家族。本专利技术的寡褐藻胶裂解酶OalC6属于PL-6家族，为本家族中第三个寡褐藻胶裂解酶，且其生物活性最高。目前报道的寡褐藻胶裂解酶的降解方式均为外切。褐藻胶单糖指饱和的和不饱和的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸，可用于发酵生产生化试剂或生物燃料。随着人口、经济发展的双重压力，地球生态环境遭到极大的破坏，地球能源日渐枯竭。生物能源作为一种重要的替代能源，世界各国空前关注。目前生物能源原料多为陆生农作物，我国人口众多，粮食需求压力长期存在，不可能大量利用粮食生产生物燃料。而利用褐藻胶作为新能源生产生物乙醇已经成为一种全新的尝试。利用褐藻胶为原料生产生物乙醇过程中将褐藻胶转化为单糖是其中必须的一步。Wargacki等将褐藻胶降解相关基因转化入大肠杆菌和酵母菌中，利用大肠杆菌和酿酒酵母以褐藻胶为能源产生生物乙醇（WargackiAJetal.Science,2012,335:308-313）。我国在此领域还属起步阶段，本专利技术的寡褐藻胶裂解酶生物活性高，具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种新型寡褐藻胶裂解酶OalC6。本专利技术的第二个目的是提供包含上述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌及其构建方法。本专利技术的另一个目的是提供上述寡褐藻胶裂解酶的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种寡褐藻胶裂解酶基因oalC6，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述寡褐藻胶裂解酶基因oalC6编码的寡褐藻胶裂解酶OalC6，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。包含上述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌，该菌株中导入了寡褐藻胶裂解酶OalC6的编码基因，所述的寡褐藻胶裂解酶基因oalC6的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述产寡褐藻胶裂解酶OalC6的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将寡褐藻胶裂解酶OalC6的编码基因克隆到质粒中，得到重组载体；(2)将重组载体转化宿主菌，得到产寡褐藻胶裂解酶OalC6的基因工程菌。步骤(1)中，所述的质粒为pET28a(+)。步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。上述寡褐藻胶裂解酶OalC6在裂解褐藻酸钠和褐藻胶寡糖中的应用在本专利技术的保护范围之内。有益效果：本专利技术所述的寡褐藻胶裂解酶OalC6来源于海洋细菌Cellulophagasp.SY116，通过设计同源引物，获得编码寡褐藻胶裂解酶OalC6的DNA序列，该基因编码区长2,328bp，编码775个氨基酸，理论分子量为85.9kDa，属于多糖裂解酶PL-6家族。大肠杆菌重组表达获得的OalC6，对古洛糖醛酸片段（polyG）具有偏好性，40℃、pH7.0条件下，在polyG底物中测得的酶活为76.8U/mg。本专利技术的褐藻胶裂解酶在生产生物乙醇开发新能源方面具有潜在的应用价值。附图说明图1：寡褐藻胶裂解酶OalC6的多重氨基酸序列比对图。图2：重组寡褐藻胶裂解酶OalC6表达纯化的聚丙烯酰氨凝胶电泳图(SDS-PAGE)。图3：温度、pH对于寡褐藻胶裂解酶OalC6的活性及稳定性影响曲线（A，不同反应温度对酶活力影响；B，酶的温度稳定性；C，不同反应pH对酶活力影响；D，酶的pH稳定性）。图4：寡褐藻胶裂解酶降解褐藻胶所得产物的电喷雾质谱(ESI-MS)分析图（A，酶解褐藻胶产物；B，酶解褐藻胶二糖；C，ESI-MS分析酶解产物）。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本专利技术，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1：寡褐藻胶裂解酶OalC6编码基因的克隆与鉴定根据与Cellulophagasp.SY116基因组中可能的寡褐藻胶裂解酶基因设计如下扩增引物：上游引物(5’-CAAAAACATACATTATAC-3’)和下游引物(5’-CTAATTAATCCTAAATTTTT-3’)。以提取的菌株基因组为模板，进行PCR扩增得到寡褐藻胶裂解酶OalC6基因全长序列。PCR条件为：94℃预变性5min，随后以94℃30s、54.8℃30s、72℃1min30s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。经基因测序后，得到寡褐藻胶裂解酶OalC6基因的全核苷酸序列全长2,328bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；编码775个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，蛋白理论分子量为85.9kDa。获得的基因oalC6的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。将上述所得PCR产生进行胶回收后，连接至pMD18-T载体上，转化至E.ColiDH5α感受态细胞中，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，提取质粒后PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆进行序列测定，将序列提交至NCBI。利用软件对OalC6与已经报道的寡藻胶裂解酶序列进行比对，并利用MEGA7.1软件构建进化树。如图1所示，寡和藻胶裂解酶归属于多糖降解酶第6家族。实施例2：寡褐藻胶裂解酶OalC6重组表达载体的构建根据寡褐藻胶裂解酶基因全序列设计上游引物(5’-CAAAAACATACATTATAC-3’)和下游引物(5’-CTAATTAATCCTAAATTTTT-3’)。进行PCR扩增得到褐藻胶裂解酶OalC6基因全长序列。PCR条件为：94℃预变性5min，随后以98℃30s、58℃30s、68℃2min进行30个循环，最后在68℃延伸10min。PCR产物和大肠杆菌表达载体pET28a(+)进行酶切，连接后转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆在含有抗性的LB液体中培养，提取质粒并酶切鉴定阳性克隆。将此重组质粒命名为pET28a-oalC6。将阳性质粒转化进入表达宿主E.coliBL21感受态细胞中。实施例3：寡褐藻胶裂解酶OalC6基因在大肠杆菌中的重组表达与纯化制备将重组表达质粒pET本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡褐藻胶裂解酶基因

【技术特征摘要】
1.一种寡褐藻胶裂解酶基因oalC6，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述寡褐藻胶裂解酶基因oalC6编码的寡褐藻胶裂解酶OalC6，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含权利要求2所述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌，其特征在于，该菌株中导入了寡褐藻胶裂解酶基因oalC6，所述的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.权利要求3所述的产寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将寡褐藻胶裂解酶基因oalC6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪红，李尚勇，韩彦弢，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37