一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一株适量产乙酸乙酯的酒酵母菌种及其构建方法，所述适量产乙酸乙酯的酵母菌株通过在醇乙酰转移酶的编码基因ATF1的ORF前插入梯度截断的PGK1启动子，敲除序列大小分别是100bp、200bp和300bp。启动子靶序列的精确敲除通过融合PCR和酵母整合质粒YIplac211来实现。构建得到ATF1的ORF前插入梯度截断的PGK1启动子的酿酒酵母突变株。在30℃玉米浓醪发酵实验证明在ATF1前分别插入截断的启动子序列，能够实现乙酸乙酯的调节，CLy12a‑P‑100，CLy12a‑P‑200 and CLy12a‑P‑300的乙酸乙酯含量相比于CLy12a‑P减少了28％，30％和42％。本发明专利技术构建的酵母菌中基因组上无外源基因残留，因此可以安全的用于生产。

【技术实现步骤摘要】
一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法
：本专利技术涉及基因工程领域，具体是涉及一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。
技术介绍
：乙酸乙酯为白酒中含量最多的风味物质之一，在白酒中呈现出令人愉悦的果香气，乙酸乙酯是我国白酒的主体酯类之一，在浓香型及酱香型酒中分别还有相当量的乳酸乙酯，己酸乙酯及少量的丁酸乙酯，这四大酯在不同香型的酒占到总酯的90％～95％，构成了我国名优白酒的主体香，此外还有少量的乙酸异戊酯和乙酸异丁酯等。酯类含量变化对白酒风味有着决定性的影响。白酒中酯类含量过高或过低都会对风味产生不良影响，含量过低，白酒香味不足，酒精味重，不适宜饮用，且容易带来饮后上头的问题；酯类含量过高，会产生青草味，脂肪臭等不愉快气味。由于乙酸乙酯含量相对较多，容易检测，因此，控制白酒中的乙酸乙酯从而控制白酒中的总酯在适量的范围内，使得酯在白酒风味中发挥积极作用。对于调节酿酒酵母中乙酸乙酯的合成，ATF1基因其中关键性作用，ATF1基因编码的醇乙酰转移酶AATaseI是催化合成乙酸乙酯的关键酶。研究发现使用强启动子PGK1等过表达ATF1基因可以构建高产乙酸酯的酿酒酵母菌株(含量可以提高2-10倍)，而且，敲出ATF1基因会导致最终的发酵产物中的乙酸酯含量减少。这些突变株所发酵的最终产物中乙酸酯含量可以通过启动子工程改变但不影响菌株的生长性能和基本发酵性。醇乙酰转移酶的酶活力的改变会影响酵母细胞产乙酸酯的能力。通过对ATF1基因的表达调控，实现酿酒酵母细胞在最终的发酵产物中酯的改变。改变目的基因的启动子强度是实现基因表达调控的重要方法。采用融合PCR方法可以实现基因片段的精确无缝拼接，而且不受酶切位点的限制避免重复操作所带来的未知影响。该方法利用融合PCR和整合型载体质粒YIplac211介导的两步整合方法，在无外源基因残留的前提下，实现对3’端不同程度敲的PGK1启动子序列无缝插入到ATF1基因序列的5’端。构建的工程菌株可以安全应运到酿酒生产中，同时融合PCR介导的两步整合方法和启动子截断调控目的基因表达的方法可以广泛应运到酵母以及其他微生物的基因表达调控，促进了基因表达调控的发展。
技术实现思路
：本专利技术解决的技术问题是提供一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。获得适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。所述适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株在正常的生长性能和发酵性能不受影响的情况下，在30℃静止玉米浓醪发酵约84小时产生的乙酸乙酯相对于发菌株提高了53％，相对于插入全长的PGK1启动子的菌株降低了30％所述适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株具体可以在出发菌株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315的ATF1基因5’端插入截断的强启动子(截断PGK1启动子的-300bp至-100bp，ATG＝+1)来实现。上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如JosephSambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；用PCR方法分别扩增1047bp的上游同源臂序列，弱化的PGK1启动子序列以及1046bp的下同源臂序列，然后通过融合PCR，分别将三段序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入酿酒酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；用二步整合重组的酵母突变株和URA3基因正常的α型菌株在KAG培养基进行杂交产孢，然后分出正常的a型酵母突变菌株，以此方法回复突变的ura3标记基因。本专利技术所述酿酒酵母菌株可应用于白酒发酵生产中。有益效果：1、本专利技术提供一种适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株以及构建方法，解决了启动子工程调节乙酸酯产量过高或者过低的问题。2、本专利技术提供的适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株是在保持优良发酵性能的前提下，醇乙酰转移酶的编码基因ATF1的表达量有一定程度的降低，进而降低了酵母细胞的AATaseI的活性，使得酵母细胞的乙酸乙酯的产量发生变化，为解决白酒生产中酯类过高或者过低提供了解决思路，而且具有重要的市场价值。3、本专利技术所使用的靶序列敲除方法，避免了酵母传统敲除过程中筛选标记残留的问题，满足自克隆的条件，可以安全的用于工业生产。并且本方法在基因精确修饰方面具有广阔的应用前景。附图说明：图1为CLy12aΔU的表型验证图2为PGK1启动子截断策略以及质粒构建示意图；(a)质粒构建示意图(以YIplac211-UPD为例，其他同理)(b)PGK1启动子截断示意图图3为融合PCR构建质粒以及两步同源重组的构建流程示意图；图4为重组质粒的酶切验证图：泳道M为15000DNAmaker；1：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD：2：YIplac211-UPD；3：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD-100；4：YIplac211-UPD-100；5：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD-200；6：YIplac211-UPD-200；7：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD-300；8：YIplac211-UPD图5为发生第一步整合重组菌株的电泳验证图：泳道M为DNAmaker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-U、CLy12aΔU-U-100、CLy12aΔU-U-200和CLy12aΔU-U-300，YIP-UPD-F和YIP-UPD-R为验证引物；6：AY15aΔU为模板；7-10：模板分别为CLy12aΔU-U、CLy12aΔU-U-100、CLy12aΔU-U-200和CLy12aΔU-U-300，YIP-UD-F和YIP-UD-R为验证引物；图6为发生第二步整合重组的菌株的电泳验证图：a泳道M为DNAmaker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12aΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300，UD-F和UD-R为验证引物；b泳道M为DNAmaker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12aΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300，UP-F和UP-R为验证引物；c泳道M为DNAmaker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100本文档来自技高网...

【技术保护点】
选育出的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的5’端通过两步重组无缝精确插入弱化的PGK1强启动子获得。

【技术特征摘要】
1.选育出的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的5’端通过两步重组无缝精确插入弱化的PGK1强启动子获得。2.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315。3.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母具有正常的生长性能并且用于正常的发酵性能以及产酒精能力，在30℃玉米原料浓醪发酵中乙酸乙酯产量相对亲本菌株提高了53％，相对于插入全长的PGK1启动子的菌株降低了30％。4.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过融合PCR技术和整合型载体质粒YIplac211介导的两步基因整合法，把强启动子PGK1的3’端-300bp至-100bp(ATG＝+1)这一序列无痕敲除来实现。5.如权利要求4所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：用PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖冬光，洪坤强，董健，郭学武，王鹏飞，陈叶福，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12