治疗神经损伤性疾病的植入神经元制备方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导间质干细胞分化为神经元的方法，特别是一种用中药作诱导剂制备用于治疗神经损伤性疾病的植入神经元的方法。包括：Ａ、骨髓间质干细胞分离、培养、扩增：取人或动物骨髓分离、培养，通过换液后传代去除其他细胞，经传代后纯化；Ｂ、用中药诱导骨髓间质干细胞分化为神经元：取纯化的间质干细胞用培养液预诱导，然后用含中药有效成分的培养液再诱导；Ｃ、细胞洗涤后备用。中药（丹参注射液、麝香多肽）无明显的毒副作用，采用其作为诱导剂诱导率高，安全性好，容易被病人接受，所诱导分化的早期神经元植入体内生长良好，能较好地重建受损神经的功能；骨髓间质干细胞取材容易，能从患者本人获得足够的骨髓间质干细胞，经扩增后，用于患者本人的治疗，疗效好，无免疫排斥等问题，临床应用前景广阔，社会效益巨大，而且能进行工业化生产以供应其他患者应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种诱导间质干细胞分化为神经元的方法，特别是一种用中药作诱导剂制备用于治疗神经损伤性疾病的植入神经元的方法。本专利技术的目的是这样实现的治疗脊髓损伤性疾病的植入神经元制备方法，包括A、骨髓间质干细胞分离、培养、扩增取人或动物骨髓分离、培养，通过换液后传代去除其他细胞，经传代后纯化；B、用中药诱导骨髓间质干细胞分化为神经元取纯化的间质干细胞用培养液预诱导，然后用含中药有效成分的培养液再诱导；C、细胞洗涤后备用。其中所述的中药为丹参注射液或麝香多肽。中药(丹参注射液、麝香多肽)无明显的毒副作用，采用其作为诱导剂诱导率高，安全性好，容易被病人接受。通过形态学和神经元表面标记物检测，丹参注射液诱导神经元的阳性细胞率为62％左右，而麝香多肽阳性率达88-93％。利用上述中药诱导分化的早期神经元植入体内生长良好，能较好地重建受损神经的功能；骨髓间质干细胞取材容易，能从患者本人获得足够的骨髓间质干细胞，经扩增后，用于患者本人的治疗，疗效好，无免疫排斥等问题，临床应用前景广阔，社会效益巨大，而且能进行工业化生产以供应其他患者应用。1、骨髓间质干细胞分离、培养、扩增及生物学特性识别。分别取人或大鼠骨髓3-5毫升，于比重为1.078分离液分离。用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培养基(L-DMEM)培养，间质干细胞很快贴壁生长，其他细胞不贴壁，通过换液化传代去除其他细胞。经2-3次传代后，基本达到纯化目的。第5代细胞表面标记物识别CD116，CD45，CD61，CD71，CD80，CD86，MHC-II表达均为阴性，而CD29和CD44阳性，证明是间质干细胞，而不是造血干细胞。每份标本原代培养可获得5-6×105细胞，传5代细胞数为1×108，10代为2×1010，15代为3-4×1012。上述细胞量已基本满足临床应用所用细胞量。2、丹参注射液和麝香多肽分别诱导骨髓间质干细胞分化为神经元。取5-10代间质干细胞用含10纳克/毫升碱性纤维生长因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)预诱导24小时，然后，分别用丹参注射液5-10微升/毫升，或麝香多肽100-150微克/毫升加进无血清L-DMEM诱导5小时-7天。神经元的确定通过形态学和神经元表面标记物检测，丹参注射液诱导神经元的阳性细胞率为62％左右，而麝香多肽阳性率达88-93％。3、丹参注射液和麝香多肽诱导分化神经元的功能实验。a、将丹参或麝香多肽诱导的早期神经元(诱导时间为2-5小时)，先用荧光染料(Hoe33342)标记，然后植入脊髓损伤处。治疗组大鼠约在7-14天后后肢瘫痪即出现恢复，持续60-90天(相当于人类长期存活)，没有异常副作用出现，经荧光金逆行追踪实验，表明损伤神经元轴索通路已经建立，大体标本及病理切片证实植入细胞无瘤样生长，生长良好，免疫组化证实已经分化为神经元。b、将丹参或麝香多肽诱导分化的早期神经元(诱导时间为2-5小时)，先用荧光染料标记，植入大鼠的纹状体。治疗组约在7-14天症状明显改善(阿扑吗啡诱导的转圈动作明显减少)，经60-90天观察，疗效一直维持，病理切片证实植入细胞在宿主纹状体生长良好，多巴胺含量(TH酶含量)明显增加。上述结果说明，用丹参或麝香多肽能高效诱导间质干细胞分化为神经元，利用上述中药诱导分化的早期神经元植入体内生长良好，能较好地重建受损神经的功能；骨髓间质干细胞取材容易，能从患者本人获得足够的骨髓间质干细胞，经扩增后，用于患者本人的治疗，疗效好，无免疫排斥等问题，临床应用前景广阔，社会效益巨大，而且能进行工业化生产以供应其他患者应用。因为人骨髓间质干细胞传15代时细胞量可达3-4×1012经液氮保存随时可取出供用。另外，体外实验表明，麝香多肽或丹参诱导骨髓间质干细胞从第二小时开始细胞形态已变为神经元样。两天后已有90％左右细胞分化为神经元，五天后(未改用维持液培养)神经元漂浮脱落，出现死亡现象。诱导2-5小时的神经元处于早期，是活力最好的时期，植入体内后，动物实验表明连续观察2-3个月(相当于人类的长期存活)，早期神经元植入使神经细胞在体内存活良好，能更有效地重建受损功能。大鼠脊髓损伤导致瘫痪的治疗65只成年SD大鼠于胸腺9-10用刀片横切约1毫米(用吸管吸出横切组织)，然后分为三组。25只为细胞治疗组，另四十只分别为空白对照组和明胶海绵对照组，细胞治疗组用含有5×105已诱导分化的早期神经元的可吸收明胶海绵植入损伤处；对照组不植入细胞。术后30天后定期行为学检查(BBB分级)，于60天和90天分批处0死动物作病理切片和荧光金逆行追踪检查。结果表明，从录像看出爬行小鼠双后肢已有不同程度恢复。BBB分级从对照组的0-4级恢复至10级左右。病理切片证实植入细胞已分化为神经元并存活90天以上。荧光金逆行追踪检查表明切片近端脊索，红核及皮层运动区均阳性。说明切断脊髓神经轴索已得到重建。大鼠帕金森病模型的治疗用6微升6-OHDO(8毫克/微升)注入右侧中脑黑质致密处一周后用apomorphine(0.5mg/kg)诱发旋转，大于7次/分为帕金森模型建立成功，然后将已诱导的早期神经元10微升含有5×105细胞注入纹状体。实验组25只，另一对照组(n＝15)仅注入培养液。术后3.7.14.21.28.56.90天观察旋转实验，并于90天处死动物作病理切片及多巴胺检测。对照组90天旋转情况未见改善。细胞治疗组于第七天开始旋转次数明显减少或消失。疗效维持90天(相当于人类长期存活)病理切片表明植入细胞存活情况良好并能迁移至周围其他部位。多巴胺检测(western blot)治疗组明显阳性，而对照组呈阴性反应。权利要求1.治疗脊髓损伤性疾病的植入神经元制备方法，包括A、骨髓间质干细胞分离、培养、扩增取人或动物骨髓分离、培养，通过换液后传代去除其他细胞，经传代后纯化；B、用中药诱导骨髓间质干细胞分化为神经元取纯化的间质干细胞用培养液预诱导，然后用含中药有效成分的培养液再诱导；C、细胞洗涤后备用。2.根据权利要求1所述植入神经元的制备方法，其中所述的中药为丹参注射液。3.根据权利要求2所述植入神经元的制备方法，其中用丹参注射液再诱导的时间为2小时-7天。4.根据权利要求2所述植入神经元的制备方法，其中丹参注射液的剂量为5-10微升/毫升。5.根据权利要求3或4所述植入神经元的制备方法，其中A、骨髓间质干细胞分离、培养、扩增取人或大鼠骨髓3-5毫升，于比重为1.077-1.078的分离液中分离，用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培养基(L-DMEM)培养，间质干细胞贴壁生长，通过换液后传代去除其他细胞，再经2-3次传代后，基本达到纯化目的；B、用丹参注射液诱导骨髓间质干细胞分化为神经元取5-10代间质干细胞，用含10纳克/毫升碱性纤维生长因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)预诱导24小时，然后用含丹参注射液的无血清L-DMEM再诱导；C、细胞洗涤后备用。6.根据权利要求1所述植入神经元的制备方法，其中所述的中药为麝香多肽。7.根据权利要求6所述植入神经元的制备方法，其中用麝香多肽再诱导的时间为2小时-7天。8.根据权利要求6所述植入神经元的制备方法，其中麝香多肽的剂量为100-150微克/毫升。9本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗脊髓损伤性疾病的植入神经元制备方法，包括：Ａ、骨髓间质干细胞分离、培养、扩增：取人或动物骨髓分离、培养，通过换液后传代去除其他细胞，经传代后纯化；Ｂ、用中药诱导骨髓间质干细胞分化为神经元：取纯化的间质干细胞用培养液预诱导，然后用 含中药有效成分的培养液再诱导；Ｃ、细胞洗涤后备用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：李树浓，邓宇斌，肖庆忠，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]