一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法及用途技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，尤其涉及一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法及用途，其方法包括以下步骤：提取待测植物的基因组DNA，获取得到序列矩阵；基于所述序列矩阵建立进化树；基于所述序列矩阵建立DNA条形码，分别取进化树和DNA条形码进行结果判断，如判断结果一致，则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。本发明专利技术建立一种标准方法准确确定牵牛属及近缘属的分类地位和物种，该鉴定方法采用叶绿体基因rbcL和核基因ITS独立分析使得到的结果相互印证，实验结论可靠且使用性更广。

A method and use for identifying the taxonomic status and species of the genus hybrida and its genera

The invention belongs to the technical field of biological detection, particularly relates to a method for identification of Pharbitis and related genera and species and taxonomic status of the purpose, the method comprises the following steps: genomic DNA extracted from plants, the obtained sequence matrix; the establishment of phylogenetic tree based on sequence matrix; the sequence matrix based on DNA barcode based on the phylogenetic tree were collected and DNA bar code to judge the results, such as judgment results, the identification results for the identification of the measured plant taxonomy and species results. The invention establishes a standard method to accurately identify taxonomic status and species of the genus Petunia and its related genera. The identification method is based on chloroplast gene rbcL and nuclear gene ITS independent analysis, and the results are mutually verified. The experimental conclusion is reliable and widely used.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法及用途
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途。
技术介绍
牵牛属是旋花科下的一个属，是一年生或多年生缠绕草本。该属约24种，广布于温带和亚热带。我国有3种，牵牛、变色牵牛、圆叶牵牛，南北均产。针对牵牛属及近缘属的相关植物，现有技术中一直存在这尚未确定分类地位的和物种的植物，例如针对国内常见的三种“牵牛”，即裂叶牵牛(PharbitishederaceaJacq.)、牵牛(Pharbitisnil(L.)Roth.)和圆叶牵牛(Pharbitispurpurea(L.)Roth)。林奈在1762年最早将它们归为ConvolvuLu属，Roth1787年又最早将圆叶牵牛转移到番薯属(Ipomoea)，而Choisy随后又将牵牛和裂叶牵牛归到牵牛属(Pharbitis)。美国学者Austin在1986年的专著中认为这是三个独立的物种，而我国分类学者方瑞征等人在《中国植物志》(1976)及《FloraofChina》(1995)中则认为他们是两个独立的物种，其中裂叶牵牛和牵牛应归为一个物种。上述方式的鉴定一般是基于形态学特征上的偏好凭经验和直觉做出的判断，没有可以重复的检验的方法。针对这三种牵牛长期的分类地位不确定性，还给诸多实践工作带来了混乱和冲突。如在《中国药典》中将三种牵牛的种子统称为“牵牛子”作为同一味药材认定，而在植物检疫中将圆叶牵牛从“牵牛”中区别出来认定为有害物种进行铲除和防范。虽然国内有相关学者做了一些分子学方面的探索性研究，但是存在实验设计和方法学上的缺陷，且得到的结论和《中国植物志》或《中国药典》矛盾，因此无法作为参考标准。目前现有的研究一般都是一个物种及一个样品，这样的取样方法忽略了物种的种内遗传多样性和种间遗传多样性的关系，得到的结果只能判定物种之间的亲缘关系远近，不能判定其分类地位和物种，只有种内多样性小于种间多样性时其物种鉴定才能成立。因此建立一种标准方法准确确定牵牛属及近缘属尤其是上述的三种常见牵牛分类地位具有重要的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，提出一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途。该方法利用多个步骤包括：获取序列矩阵、建立进化树、建立DNA条形码分别独立分析进行鉴定，将获取的鉴定结果相互印证，具有重复性，使实验结论更可靠且使用性更广。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，包括以下步骤：步骤1：提取待测植物的基因组DNA；以待测植物的基因组DNA为模板，以分子标记的引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行双向测序，对序列进行拼接和纠正，获取得到序列矩阵；步骤2：基于所述序列矩阵建立进化树，比较待测植物在进化树的位置和支系情况；步骤3：基于所述序列矩阵建立DNA条形码，确定DNA条形码的间隔区的大小和位置；步骤4：对比步骤2和步骤3获取待测植物相应的鉴定结果，当步骤2和步骤3的鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。作为优选：所述步骤1中分子标记为叶绿体DNA的rbcL基因，所述rbcL基因的上游引物的序列为SEQIDNO：1所示，下游引物的序列为SEQIDNO：2所示。作为优选：所述rbcL基因在步骤1中的扩增程序为：94℃预热4min；94℃30s，50℃30s，72℃1.0min，36个循环；72℃10min。作为优选：所述步骤1中分子标记为核糖体DNA的ITS基因，所述ITS基因的上游引物的序列为SEQIDNO：3所示，下游引物的序列为SEQIDNO：4所示。作为优选：分别取以rbcL基因和ITS基因作为分子标记获取的步骤2和步骤3的鉴定结果进行对比，如鉴定结果一致，则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。作为优选：建立进化树的方法为邻接法。作为优选：如进化树显示支系数量为单系，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于不同分类地位和物种，如进化树显示支系数量为多个且每个支系中同时混杂着多个待测物种，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种；如进化树显示支系数量为多个，且满足每个支系中同时混杂着多个待测物种，当多个支系之间存在产生杂交的两个物种，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种。作为优选：当DNA条形码中有间隔，则步骤3鉴定多个待测物种之间不属于相同分类地位和物种；当DNA条形码中无间隔，则步骤3鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种。作为优选：所述的牵牛属及近缘属为裂叶牵牛(PharbitishederaceaJacq.)、牵牛(Pharbitisnil(L.)Roth.)和圆叶牵牛(Pharbitispurpurea(L.)Roth)。一种上述鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法在鉴定裂叶牵牛(PharbitishederaceaJacq.)、牵牛(Pharbitisnil(L.)Roth.)和圆叶牵牛(Pharbitispurpurea(L.)Roth)的分类地位和物种的应用。一种权上述鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法在鉴定中药材牵牛子中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：1、已知常用的rbcL基因仅能部分扩增待测产物的DNA，通过设计牵牛属及近缘属的特异PCR扩增引物，实现对待测物种和已知物种的扩增效率为100％，同时对中药材“牵牛子”的扩增效率为83.3％，满足PCR实验要求，使最终获取的鉴定结果更加可靠准确。2、本专利技术可以分别独立采用rbcL基因和ITS基因进行PCR扩增获取相应的序列矩阵，针对分别获取的序列矩阵建立进化树和条形码，将两组序列矩阵获取的最终鉴定结果进行比较，以相互印证鉴定结果，使获取的鉴定结果更加准确。3、本专利技术的牵牛属及近缘属通用的分子标记及其用途和鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法，能够对多个不同来源的牵牛属及近缘属样品进行分析，不仅能够得到牵牛属及近缘属物种之间的关系，同时还能获取到每种牵牛属或近缘属的植物的分类地位和物种。4、提供了可确立国内三种常见牵牛即裂叶牵牛(PharbitishederaceaJacq.)、牵牛(Pharbitisnil(L.)Roth.)和圆叶牵牛(Pharbitispurpurea(L.)Roth)的分类地位的基因、扩增引物和扩增条件，解决了实际应用中涉及到的“牵牛”的身份问题，如可用于中药材“牵牛子”(黑丑和白丑)、海关和出入境检疫的“圆叶牵牛”。5、本专利技术将建树分析结果与DNA条形码间隔分析结果相互验证、杂交现象与生物学物种概念相印证，同时基于不同基因的鉴定结果相互验证，使本专利技术最终获取的鉴定结果更加准确，且可重复性性强。附图说明图1为本专利技术实施例所述进化树构建方法筛选比较图；图2为本专利技术实施例采用rbcL基因和ITS基因构建的进化树比较图；图3为本专利技术实施例采用rbcL基因获取的遗传距离对比柱状图；图4为本专利技术实施例采用ITS基因获取的遗传距离对比柱状图；具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：提取待测植物的基因组DNA；以待测植物的基因组DNA为模板，以分子标记的引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行双向测序，对序列进行拼接和纠正，获取得到序列矩阵；步骤2：基于所述序列矩阵建立进化树，比较待测植物在进化树的位置和支系情况；步骤3：基于所述序列矩阵建立DNA条形码，确定DNA条形码的间隔区的大小和位置；步骤4：对比步骤2和步骤3获取待测植物相应的鉴定结果，当步骤2和步骤3的鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：提取待测植物的基因组DNA；以待测植物的基因组DNA为模板，以分子标记的引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行双向测序，对序列进行拼接和纠正，获取得到序列矩阵；步骤2：基于所述序列矩阵建立进化树，比较待测植物在进化树的位置和支系情况；步骤3：基于所述序列矩阵建立DNA条形码，确定DNA条形码的间隔区的大小和位置；步骤4：对比步骤2和步骤3获取待测植物相应的鉴定结果，当步骤2和步骤3的鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。2.根据权利要求1所述的鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，其特征在于：所述步骤1中分子标记为叶绿体DNA的rbcL基因，所述rbcL基因的上游引物的序列为SEQIDNO：1所示，下游引物的序列为SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求2所述的鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，其特征在于：所述rbcL基因在步骤1中的扩增程序为：94℃预热4min；94℃30s，50℃30s，72℃1.0min，36个循环；72℃10min。4.根据权利要求2所述的鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，其特征在于：所述步骤1中分子标记为核糖体DNA的ITS基因，所述ITS基因的上游引物的序列为SEQIDNO：3所示，下游引物的序列为SEQIDNO：4所示。5.根据权利要求4所述的鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，其特征在于：分别取以rbc...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵秀玲，张伟，范晓虹，吴兴海，厉燕，张京宣，宋涛，王简，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37