本发明专利技术公开了一种基于Dal80p为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、加麦曲加发酵剂加水、拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理；发酵剂中含有敲除了DAL80基因的酿酒酵母菌粉。本发明专利技术以转录抑制因子Dal80p为调控靶标，采用酿酒酵母DAL80敲除菌部分或全部替换传统发酵剂酒药进行黄酒酿造，能有效抑制酿造过程中氨基甲酸乙酯的形成，同时受限因素少，对成品黄酒的酒精度、风味和品质影响不显著。
【技术实现步骤摘要】
一种基于Da 180p为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造 方法
本专利技术涉及食品安全与发酵酿造领域，尤其涉及一种基于DalSOp为靶标抑制氨基 甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法。
技术介绍
黄酒是我国传统酿造的特色发酵饮品，黄酒中保留了发酵过程中的营养物质和活 性物质，对人体具有抗癌、抗衰老和保健功能，因此传统黄酒越来越受推崇。但是黄酒酿造 过程中，含氮化合物的不完全代谢使发酵液中积累大量氨基甲酸乙酯前体物尿素，尿素能 够与乙醇作用生成氨基甲酸乙酯，2007年，氨基甲酸乙酯被国际癌症研究机构提升为2A级 另IJ，即对人类具有潜在致癌性。因此控制黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯形成是当前食品生 物安全领域的研究热点。 黄酒酿造过程中，氨基甲酸乙酯最主要前体物尿素主要来源于发酵原料和发酵过 程中酿酒酵母对精氨酸的利用。精氨酸在精氨酸酶和鸟氨酸转氨酶的连续作用下降解为尿 素，生成的尿素在脲酶作用下进一步降解为谷氨酸盐和二氧化碳。但在实际发酵过程中，氮 代谢抑制调控机制抑制尿素的进一步降解，因此发酵过程中不断积累大量尿素，并与乙醇 作用生成氨基甲酸乙酯。 目前基于氨基甲酸乙酯形成前体物的代谢途径，黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的 抑制途径主要包括，外源添加酸性脲酶和基因工程手段改造发酵菌株。研究报道黄酒中通 过外源添加酸性脲酶能较高水平的降低发酵液中的尿素和氨基甲酸乙酯浓度(参考文献： Jun LiujYao Nie,Guang-ao Zhao,Optimization production of acid urease by Enterobacter sp. in an approach to reduce urea in Chinese rice wine .Bioprocess and biosystems engineering，2012.35(4) :651-657)，但应用该方法也受很 多因素的影响，如酒的品种、发酵过程实际应用条件及发酵液中的抑制因子，其中被证实的 抑制因子包括氟化物、苹果酸盐、乙醇及酚类等化合物。基因工程手段改造发酵菌株主要包 括敲除精氨酸酶基因和过表达脲酶编码基因，利用改造后的菌株进行黄酒酿造实验，结果 表明，发酵液中尿素浓度分别降低95.8%和86.9% (参考文献:DianhuiWu,XiaomingLi， ChaoShen,et al.Decreased ethyl carbamate generation during Chinese rice wine fermentation by disruption of CARlin an industrial yeast strain .International journal of food microbiology,2014.180:19-23；Yuqing YangjZhen Kang ,Jianli Zhou , et al. High-level expression and characterization of recombinant acid urease for enzymatic degradation of urea in rice wine ? Applied microbiology and biotechnology，2015,99(l) :301-308. )D应用精氨酸酶基因 敲除菌株进行黄酒酿造虽然对氨基甲酸乙酯的调控有显著作用，但精氨酸的利用途径被切 断，造成发酵液中精氨酸的积累，最终影响酿造产品的风味与品质。 目前，氮代谢抑制调控机制对尿素和精氨酸降解途径的调控作用被进一步解析， 这为黄酒酿造中氨基甲酸乙酯的抑制途径提供新的靶标和思路。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于DalSOp为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，能 有效抑制传统黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的形成，同时受限因素少，对成品黄酒的酒精 度、风味和品质影响不显著。 一种基于DalSOp为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、 淋水、加麦曲加发酵剂加水、拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理;所述发酵剂中含有敲除 了 DAL80基因的酿酒酵母菌粉。 尿素是黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯形成的最主要前体物，根据已有研究报道， DalSOp是一种在氮代谢阻遏条件下起抑制作用的转录调控因子，本研究在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达蛋白Da180p，并通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证了Da180p对尿素降解酶的转录 抑制作用，为此，本专利技术从这一角度出发，将敲除了DAL80基因的酿酒酵母添加到发酵剂中， 从而实现黄酒酿造过程中降低尿素含量、抑制氨基甲酸乙酯形成的目的。 传统黄酒酿造工艺可以采用淋饭法，包括浸米、蒸饭、淋水、加麦曲加发酵剂加水、 拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理。 所述的米可以为糯米、粳米和籼米中的至少一种。浸米时，以每千克米计，水的用 量可以为1.0-1.5L，优选为1.2L。 所述浸米温度可以为25-30Γ，浸米时间可以为1-3天，具体条件可根据米质、水温 不同而有所差异。优选地，所述浸米温度为28 °C，浸米时间为2天。 传统黄酒酿造中多采用酒药作为发酵剂，酒药中的微生物主要为酿酒酵母，在酿 造过程中起发酵作用。本专利技术中，所述敲除了DAL80基因的酿酒酵母菌粉可以为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)YSC6273-201937947菌粉。酿酒酵母YSC6273-201937947购于 通用电气医疗集团生命科学部（GE Healthcare Life Sciences)，菌株编号YSC6273-201937947,为敲除了DAL80基因的酿酒酵母（DAL8〇A，Yeast MATa Knock Out Strain YKR034W，Cloneld:7047)。 优选地，所述发酵剂可以为酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉和酒药的混合物;更 优选地，所述发酵剂为酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉。以敲除了 DAL80基因的酿酒酵母 菌粉部分或全部替代酒药，不但能有效抑制酿造中氨基甲酸乙酯的形成，还能保持黄酒原 有的风味和品质;特别地，全部替代时对氨基甲酸乙酯的抑制效果最好。根据本研究结果， 利用酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉全部替代酒药进行发酵，糖化、发酵30天后，黄酒成 品中氨基甲酸乙酯的浓度降低38.5%，且酒精度、风味物质组成、和氨基酸组成差异不大。 所述酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉可以通过如下方法制备：将酿酒酵母 YSC6273-201937947进行发酵培养，收集菌体、冷冻干燥后制得。 以每千克米计，所述麦曲的加入量为60-200g，发酵剂的加入量为l-5g，水的加入 量为1.0-1.5L;优选地，以每千克米计，所述麦曲的加入量为180g，发酵剂的加入量为2g，水 的加入量为1.2L。添加麦曲主要起糖化作用。发酵剂添加过多会大量消耗营养物质，添加过 少达不到发酵效果。 所述落缸搭窝为米饭中加入麦曲、发酵剂和水后，在发酵缸内搭成凹形窝。 所述糖化温度可以为25-30°C，糖化时间为4-6天;优选地，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种基于DalSOp为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋 水、加麦曲加发酵剂加水、拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理，其特征在于:所述发酵剂中 含有敲除了 DAL80基因的酿酒酵母菌粉。2. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述浸米时，以每千克米计，水的用 量为 1.0-1.5L。3. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述浸米温度为25-30Γ，浸米时间 为1_3天。4. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述敲除了DAL80基因的酿酒酵母 菌粉为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YSC6273_201937947菌粉。5. 如权利要求1所述的黄酒酿造...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，焦志华，周万怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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