一种氨基甲酸乙酯半抗原组合、人工抗原组合及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种氨基甲酸乙酯人工抗原组合、人工抗原组合及其制备方法与应用。所述氨基甲酸乙酯人工抗原组合具有式（Ⅲ）和式（Ⅳ）所示分子结构，采用本发明专利技术的人工抗原得到的抗血清的效价可达到1.28×105，最低检测限为0.16mg/L，半抑制浓度为1.19mg/L，制备的抗体特异性高，灵敏度高，准确度高，可建立检测氨基甲酸乙酯的免疫分析方法，实现对食品中氨基甲酸乙酯进行高通量筛查，提高检测效率，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品安全免疫检测
，具体地，涉及一种氨基甲酸乙酯半抗原组合、人工抗原组合及其制备方法与应用。
技术介绍
氨基甲酸乙酯(EthylCarbamate，简称EC)或称为尿烷(Urethane)，分子式为C3H7NO2，是一种广泛存在于发酵食品尤其是酒精饮料中的化学污染物。1943年Nettleship等发现氨基甲酸乙酯可以导致小鼠细胞癌变和肿瘤的形成后，在许多模式动物(大鼠、小鼠、仓鼠和猴子等)试验中都证明了氨基甲酸乙酯的致癌性。1974年国际癌症研究机构(IARC)将氨基甲酸乙酯列为2B类的致癌化合物。1993年Cadraney等进一步证实氨基甲酸乙酯可以直接诱发人患肝癌，因此，2007年国际癌症研究机构(IARC)进一步将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B提升到了2A。随着检测技术的发展，越来越多发酵食品尤其是酒精饮品中陆续检测出氨基甲酸乙酯。由于氨基甲酸乙酯的致癌性，很多国家对酒精饮品中的氨基甲酸乙酯残留都做出严格规定。例如，加拿大早在1985就限定佐餐葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量不得超过30ng/mL，加烈葡萄酒100ng/mL、蒸馏酒150ng/mL、清酒200ng/mL、白兰地400ng/mL。随后，美国、法国、德国等也都设立了相关标准。目前，我国暂未正式制定公布氨基甲酸乙酯限量标准，但食品安全部门已经在认真的考虑中，相信不久将来就会出台相关的氨基甲酸乙酯残留限量标准条例。目前，国内外检测氨基甲酸乙酯的常用方法主要有气相色谱、高效液相色谱、气相色谱与-质谱等方法，但这些方法样品主要依赖大型仪器、预处理要求高、步骤复杂、需专业人员操作、检测费用高、很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原抗体特异性结合的的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、高特异性等优点，越来越被关注。目前尚无免疫检测的氨基甲酸乙酯半抗原、抗原和抗体的相关报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种氨基甲酸乙酯半抗原组合。本专利技术的另一个目的是提供一种氨基甲酸乙酯人工抗原组合。本专利技术的再一个目的是提供一种氨基甲酸乙酯半抗原组合的制备方法。本专利技术的再一个目的是提供一种氨基甲酸乙酯人工抗原组合的制备方法。本专利技术的再一个目的是提供一种氨基甲酸乙酯抗体。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种氨基甲酸乙酯半抗原组合，包括免疫半抗原和包被半抗原，免疫半抗原具有式(I)所示分子结构，包被半抗原具有式(Ⅱ)所示分子结构；式(I)；其中m＝0～2；式(Ⅱ)；其中：n＝1～5。如上所述氨基甲酸乙酯半抗原组合对应的人工抗原组合，包括免疫人工抗原和包被人工抗原，免疫人工抗原具有式(Ⅲ)所示分子结构，包被人工抗原具有式(Ⅳ)所示分子结构；式(Ⅲ)，其中m＝0～2；式(Ⅳ)，其中n＝1～5。优选地，如上所述氨基甲酸乙酯半抗原组合的制备方法，免疫半抗原的制备方法为：将焦碳酸二乙酯滴加到具有式(Ⅴ)所示化合物的NaHCO3溶液中，室温搅拌反应过夜，反应结束后将反应液调酸，过滤，用蒸馏水洗涤沉淀，烘干即得；式(Ⅴ)；其中m＝0～2；包被半抗原的制备方法为：将焦碳酸二乙酯滴加到式(Ⅵ)所示化合物的水溶液中，室温搅拌反应过夜，反应完后，旋蒸除去水溶液即得；式(Ⅵ)；其中n＝1～5。更优选地，所述焦碳酸二乙酯与式(Ⅴ)所示化合物的摩尔比为1～2:1，NaHCO3溶液的浓度为0.5～1mol/L。更优选地，所述焦碳酸二乙酯与式(Ⅵ)所示化合物的摩尔比为1～2:1。式(Ⅲ)和式(Ⅳ)所述氨基甲酸乙酯人工抗原组合的制备方法，将式(I)所示的免疫半抗原与载体蛋白偶联制备得到免疫人工抗原，将式(Ⅱ)所示的包被半抗原与载体蛋白偶联制备得到包被人工抗原。优选地，式(Ⅲ)和式(Ⅳ)所述氨基甲酸乙酯人工抗原组合的制备方法为：将式(I)所示的免疫半抗原和式(Ⅱ)所示的包被半抗原分别与N,N’-二环己基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺反应形成活泼酯；将活泼酯滴加入载体蛋白溶液中，反应过夜；偶连有半抗原的载体蛋白经过3天的透析纯化，即得免疫人工抗原和包被人工抗原。更优选地，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。采用式(Ⅲ)和式(Ⅳ)所示分子结构的氨基甲酸乙酯人工抗原组合制备得到的氨基甲酸乙酯单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。所述氨基甲酸乙酯单克隆抗体的具体制备方法为：用式(Ⅲ)所示分子结构的氨基甲酸乙酯人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对氨基甲酸乙酯的抗体，所述抗体是能与氨基甲酸乙酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白G。式(Ⅲ)和式(Ⅳ)所示分子结构的氨基甲酸乙酯人工抗原组合在检测氨基甲酸乙酯中的应用，具体的检测方法可以是ELISA法或其他的免疫检测法。一种氨基甲酸乙酯的ELISA检测方法，利用式(Ⅲ)所示免疫人工抗原和式(Ⅳ)所示包被人工抗原组合，建立ELISA检测方法。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：当前检测氨基甲酸乙酯的方法大多基于液相、气相色谱及其与质谱联用的仪器检测方法，这些方法成本高，样品前处理复杂。目前，还未发现针对氨基甲酸乙酯免疫检测技术的报道。本专利技术提供了几种氨基甲酸乙酯半抗原、抗原及抗体制备方法及应用。其思路是保留氨基甲酸乙酯结构的前提下，引入带有芳香性结构的手臂，增加半抗原分子的分子量及芳香性，更有益于半抗原分子诱导动物机体产生识别氨基甲酸乙酯的特异性抗体。以含饱和碳链为手臂氨基甲酸乙酯的半抗原偶联载体蛋白得到的人工抗原作为包被原，可以消除免疫半抗原手臂中芳香结构诱导产生的臂抗体的干扰。该思路的有益效果体现在：以式(Ⅲ)所示免疫人工抗原诱导产生的针对氨基甲酸乙酯的特异性抗体，以式(Ⅳ)所示人工抗原作为包被原，可建立检测氨基甲酸乙酯的免疫分析方法，实现对食品中氨基甲酸乙酯进行高通量筛查，提高检测效率，降低检测成本。附图说明图1为半抗原AⅠ(m＝1)及其免疫抗原、包被抗原紫外扫描图。图2为以载体蛋白为KLH的人工抗原I(m＝1,KLH为载体蛋白)为免疫原所制备的单克隆抗体在以人工抗原Ⅱ(n＝3，OVA为载体蛋白)对氨基甲酸乙酯的ELISA抑制曲线。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。实施例1氨基甲酸乙酯半抗原AⅠ(m＝0)制备方法将1.37g4-氨基苯甲酸溶于30mL的1mol/L的碳酸氢钠溶液，向该溶液滴加焦碳酸二乙酯2mL，室温搅拌反应过夜，反应完后，将反应混合液调酸至pH为1～2，有白色沉淀析出，过滤沉淀，蒸馏水洗涤烘干得到白色固体1.78g即为半抗原AⅠ(m＝0)。ESI-MSanalysis(negative)m/z190[M-H]–；1HNMR(600MHz,MeOD)δ7.97–7.93(m,2H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H),4.21(q,J＝7.1Hz,2H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H).实施例2氨基甲酸乙酯半抗原AⅠ(m＝1)制备方法将1.51g4-氨甲基苯甲酸溶于30mL的1mol/L碳酸氢钠溶液，向该溶液滴加焦碳酸二乙酯2mL，室温搅拌反应过夜，反应完后，将反应混合液调酸至pH为1～2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氨基甲酸乙酯半抗原组合，包括免疫半抗原和包被半抗原，其特征在于，免疫半抗原具有式(I)所示分子结构，包被半抗原具有式(Ⅱ)所示分子结构；式(I)；其中m＝0～2；式(Ⅱ)；其中：n＝1～5。

【技术特征摘要】
1.一种氨基甲酸乙酯半抗原组合，包括免疫半抗原和包被半抗原，其特征在于，免疫半抗原具有式(I)所示分子结构，包被半抗原具有式(Ⅱ)所示分子结构；式(I)；其中m＝0～2；式(Ⅱ)；其中：n＝1～5。2.权利要求1所述氨基甲酸乙酯半抗原组合对应的人工抗原组合，包括免疫人工抗原和包被人工抗原，其特征在于，免疫人工抗原具有式(Ⅲ)所示分子结构，包被人工抗原具有式(Ⅳ)所示分子结构；式(Ⅲ)，其中m＝0～2；式(Ⅳ)，其中n＝1～5。3.权利要求1所述氨基甲酸乙酯半抗原组合的制备方法，其特征在于，免疫半抗原的制备方法为：将焦碳酸二乙酯滴加到具有式(Ⅴ)所示化合物的NaHCO3溶液中，室温搅拌反应过夜，反应结束后将反应液调酸，过滤，用蒸馏水洗涤沉淀，烘干即得；式(Ⅴ)；其中m＝0～2；包被半抗原的制备方法为：将焦碳酸二乙酯滴加到式(Ⅵ)所示化合物的水溶液中，室温搅拌反应过夜，反应完后，旋蒸除去水溶液即得；式(Ⅵ)；其中n＝1～5。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述焦碳酸二乙酯...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，孙远明，罗林，杨金易，雷红涛，沈玉栋，王弘，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44