电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法。检测池腔体分为用石英片连接的进样池腔体和渗透池腔体，石英片设有中心通孔并安装有修饰酶的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的圆片，检测电极插入到进样池和渗透池腔体中；在多孔阳极氧化铝纳米孔阵列上修饰酶，再固定于打孔石英片，将打孔石英片置于进样池和渗透池之间形成检测池，加入反应底物，触发酶催化反应在纳米孔道中生成聚合物形成沉淀，检测通道电流获得电流‑时间数据作出图计算得到酶动力学参数。本发明专利技术不需要复杂的材料和装置，有效避免检测反应产物受外界因素干扰的缺点，具有灵敏度高、检测成本低、检测限低等优点。

Device and method for space domain enzyme catalytic kinetic monitoring of nano electrical Limited

The invention discloses a device and a method for monitoring electrical nano confinement space enzyme catalytic kinetic. Cell cavity is divided into quartz plate connecting sample cell cavity and osmotic pool cavity, quartz plate is provided with a central through hole and is provided with a porous anodic alumina nano pore array modified enzyme of the wafer, the detection electrode inserted into the sample pool and pool penetration chamber; enzymatic modification of porous anodic alumina nano hole array. Fixed to the punch punch quartz quartz glass piece, the piece is arranged in the sample pool and infiltration basin formed between the detection pool, added to the reaction substrate, enzyme catalytic reaction triggered polymer precipitation in the nanopores, data detection channel current to obtain the current time to figure calculated kinetic parameters. The invention does not need complicated materials and devices, and effectively avoids the interference of external factors of the reaction product. The utility model has the advantages of high sensitivity, low detection cost and low detection limit.

【技术实现步骤摘要】
电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法
本专利技术属于一种定量检测纳米限域空间内酶活性的生物传感技术，具体涉及一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法，利用纳米孔道阵列监测酶在纳米限域空间内催化沉积。
技术介绍
酶是广泛存在生物体内的活性物质，具有催化效率高、选择性强、反应条件温和等优点，广泛应用于合成、催化、燃料电池等领域。多年来，水溶性酶的结构、稳定性和催化能力是通过溶解在一定成分浓度和温度缓冲水溶液中来分析它们的结构，研究它们的催化活性。从这个角度来说，某种经纯化可溶性酶的体外特性可以用来阐述酶催化特定化学反应能力及反应机制。然而，简单缓冲溶液并不能反映酶催化通常发生在成分复杂的生物介质环境。大多数生物体内酶催化反应发生在分子拥挤的环境中或在限域空间内，如在表面上，嵌入表面，或在体积小内。因此，体内感兴趣的酶在被综合模拟时这些因素是需要被考虑的。传统的酶活性检测是在体外缓冲溶液中进行，无法反应酶在体内空间受限情况的催化性能。离子通道又称为膜蛋白，嵌入细胞膜在生命活动中扮演至关重要的角色。受到蛋白质通道的启发，固态纳米通道相比生物纳米通道具有良好的机械强度，通道大小可调，容易进行功能修饰的优点，近年来引起越来越多的研究兴趣。在固态纳米通道内检测酶的活性可以很好地模拟酶在限域空间内的催化性能。目前现有的固态纳米通道内检测酶活性的研究方法主要是基于荧光和电化学检测方法。现有技术有的在检测端粒酶活性过程中，在钾离子存在形成G-四联体，对通过纳米孔道的指示分子产生的电化学信号进行检测。还有的在检测疾病相关的脂肪酸分子和醛类分子采用电化学阻抗信号变化。这些检测方法都仅对反应前后两种状态的信号进行检测，无法对酶催化反应的整个过程进行监测，不能得到酶催化动力学参数。这些检测方法无法收集游离产物的实时信号，其检测过程也会受到扩散和传质影响，导致信号收集效率低。因此，结合纳米通道阵列和酶催化沉积的优势发展对酶催化过程进行简单、灵敏地分析监测，实现对酶动力学过程进行分析具有重要的意义，为开发更为灵敏的检测手段提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法。本专利技术中针对酶催化生成聚合物，聚合物在纳米通道中沉积从而使通道的有效孔径减小，通过适时测定通道离子电流信号来监测酶催化过程，根据得到的电流-时间信号，计算出酶催化动力学参数。本专利技术的目的是通过以下的技术方案来实现的：一、一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置：包括检测池腔体和检测电极，检测池腔体分为进样池腔体和渗透池腔体，进样池腔体和渗透池腔体之间通过打孔石英片连接，所述的石英片设有中心通孔，中心通孔处安装修饰酶的多孔阳极氧化铝圆片，进样池腔体和渗透池腔体的腔体上端设有检测电极，检测电极下端插入到进样池腔体和渗透池腔体中。所述的修饰酶的多孔阳极氧化铝圆片通过环氧树脂胶固定粘接在中心通孔的一侧所述的孔端面，使得阳极氧化铝圆片的中心和中心通孔的中心重合。所述的石英片尺寸为20mm*20mm*0.5mm，中心通孔为直径0.2mm～3mm的圆孔。所述的检测电极采用双Ag/AgCl饱和KCl溶液电极。所述检测电极连接到电化学工作站。二、一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的方法，包括以下步骤：(1)在多孔阳极氧化铝(Anodicaluminumoxide，AAO)纳米孔阵列的孔壁上修饰酶；(2)将修饰酶的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列固定于打孔石英片的中心通孔，将打孔石英片置于进样池和渗透池之间，制作形成检测池；进样池和渗透池中均加入PBS溶液。(3)向进样池中加入反应底物，触发多孔阳极氧化铝纳米孔阵列上的修饰酶发送催化反应，并在中心通孔的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的纳米孔道中生成聚合物，形成沉淀；(4)利用电学方法对通过多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的纳米孔道的通道电流进行实时监测，间隔采集到不同时刻的电流数据；(5)根据采集到的电流-时间数据拟合绘制电流-时间关系曲线，作出Lineweaver-Burk图，根据Lineweaver-Burk图计算得到酶动力学参数。所述的酶动力学参数包括米氏常数(KM)和最大反应速度(Vmax)。所述步骤(5)中，在获得电流-时间关系曲线后，对电流-时间关系曲线进行归一化处理，具体方法是以在PBS溶液中稳定后的电流平均值作为基准值，将加入反应物前后的电流除以基准值即得到归一化曲线，先计算反应初期50s内电流下降速率作为酶促反应速率v，接着根据酶促反应速率v的倒数1/v对反应底物浓度s的倒数1/s作Lineweaver-Burk图，Lineweaver-Burk图中曲线分别在x和y轴上的截距分别作为米氏常数(KM)和最大反应速度(Vmax)的倒数。这两个参数就可以反映酶在纳米限域空间内催化活性。所述步骤(1)中所选用的纳米通道阵列是采用多孔阳极氧化铝(Anodicaluminumoxide，AAO)，孔径为10nm～150nm，优选为30nm，使用前裁剪成直径为0.2mm～10mm的圆片。所述步骤(1)中的酶采用酶促催化沉积的酶。采用但不限于辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、尿酶(urease)、漆酶(laccase)或者[辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶]、[辣根过氧化物酶和胆碱氧化酶]组成的复合酶体系。所述步骤(3)中的反应底物包括与所用酶对应特异性催化的底物和聚合物基底物。与所用酶对应特异性催化的底物采用但不限于与辣根过氧化物酶HRP对应的过氧化氢(H2O2)、与碱性磷酸酶ALP对应的对硝基苯磷酸二钠(pNPP)、与尿酶对应的尿素，与漆酶对应的对苯二酚，葡萄糖氧化酶对应的葡萄糖，胆碱酶对应的乙酰胆碱。所述聚合物基底物为苯二胺。所述的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的孔径为10nm～150nm。所述步骤(4)是用两电极分别置于进样池和渗透池中，在两电极上加载恒定电压，电压范围为-0.5V～0.5V，通过线性扫描伏安法表征纳米通道中催化反应电流变化，然后记录电流-时间数据，获得聚合物在纳米孔道中沉积情况。所述步骤(4)的电学方法是采用双Ag/AgCl饱和KCl溶液电极进行检测，双Ag/AgCl饱和KCl溶液电极分别置于进样池和渗透池中。本专利技术的有益效果是：本专利技术结合酶催化效率高和纳米通道的优势，利用监测通道电流的方法直接检测限域空间内酶催化反应活性，不需要复杂的材料和装置，制作出简易检测池，检测通道电流信号来监测酶催化沉积过程，并评价纳米限域空间内催化活性。本专利技术有效避免检测反应产物受外界因素干扰的缺点，具有灵敏度高、检测成本低、检测限低等优点，并且方法快速、高效、成本低。附图说明图1为实施例1中阳极氧化铝纳米孔阵列修饰HRP过程示意图。图2为实施例1中HRP、极氧化铝纳米孔阵列和HRP修饰阳极氧化铝纳米孔阵列的傅里叶变换红外光谱图。图3为实施例1中制作纳米孔阵列检测装置示意图。图4为实施例2中为不同浓度HRP修饰阳极氧化铝纳米孔阵列的电压-电流曲线。图5为实施例2中为加入反应物后的电流-时间曲线。图6为实施例2中反应前后验证图，其中a为反应前后扫描电镜图，b为反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置，其特征在于：包括检测池腔体和检测电极，检测池腔体分为进样池腔体和渗透池腔体，进样池腔体和渗透池腔体之间通过打孔石英片连接，所述石英片设有中心通孔，中心通孔处安装有修饰酶的多孔阳极氧化铝圆片，检测电极下端插入到进样池腔体和渗透池腔体中。

【技术特征摘要】
1.一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置，其特征在于：包括检测池腔体和检测电极，检测池腔体分为进样池腔体和渗透池腔体，进样池腔体和渗透池腔体之间通过打孔石英片连接，所述石英片设有中心通孔，中心通孔处安装有修饰酶的多孔阳极氧化铝圆片，检测电极下端插入到进样池腔体和渗透池腔体中。2.根据权利要求1所述的一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置，其特征在于：所述的多孔阳极氧化铝圆片通过环氧树脂胶固定粘接在中心通孔的一侧所述的孔端面，使得阳极氧化铝圆片的中心和中心通孔的中心重合。3.根据权利要求1所述的一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置，其特征在于：所述的石英片尺寸为20mm*20mm*0.5mm，中心通孔为直径0.2mm～3mm的圆孔。4.一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)在多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的孔壁上修饰酶；(2)将修饰酶的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列固定于打孔石英片的中心通孔，将打孔石英片置于进样池和渗透池之间，制作形成检测池；(3)向进样池中加入反应底物，触发多孔阳极氧化铝纳米孔阵列上的修饰酶发生催化反应，并在中心通孔的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的纳米孔道中生成聚合物，形成沉淀；(4)利用电学方法对通过多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的纳米孔道的通道电流进行实时监测，间隔采集到不同时刻的电流数据；(5)根据采集到的电流-时间数据拟合绘制电流-时间关系曲线，作出Lineweaver-Burk图，根据Lineweaver-Burk图计算得到酶动力学参数。5.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李延斌，傅迎春，戴煌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33