拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用制造技术

本发明专利技术公开了拟南芥基因

【技术实现步骤摘要】
拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用。
技术介绍
微丝解聚因子（ADF/cofilin）广泛存在于真核细胞中，对维持细胞的形态结构、细胞运输、能量转换、信息传递、细胞分裂及分化等起着非常重要的作用。前期研究表明，拟南芥微丝解聚因子ADF1表达量变化会影响植物的开花期，ADF1表达量的降低导致开花延迟。野生型拟南芥约在35±1天开花，有17片莲座叶；而ADF1基因沉默植株开花较野生型延迟2周，莲座叶数目增加至26片。其后，人们通过基因敲除深入解析ADF在植物生长发育中的分子功能。拟南芥adf4突变体具有更长的下胚轴和表皮细胞。拟南芥ADF9的突变体（adf9-1，adf9-2）植株的顶端优势增强，其花序的二级分枝数目少于野生型，但分枝的长度比野生型长；长日照生长条件下突变体开花时间早于野生型，同时莲座叶数目比野生型少，而短日照生长条件下跟野生型相比没有明显差异。此外，ADF9能调控开花转换时期相关基因的表达量。这些研究表明，ADF蛋白直接参与植物生长发育及花期调控，但其调控的目标基因、参与的关键调控因子及分子调控机制等都不清楚。
技术实现思路
本专利技术提供了拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用。本专利技术以拟南芥ADF1为诱饵，通过酵母双杂交从拟南芥cDNA文库中筛选得到了十几个ADF1互作蛋白分子，获得本专利技术所述的基因REM16(基因编号为AT3G53310)，并通过实验证明了其调控拟南芥花期的功能。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种拟南芥基因REM16的过表达载体pCambia1300-221-HA，所述过表达载体pCambia1300-221-HA的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:2所示，所述过表达载体含有如序列表SEQIDNo:1所示的基因REM16，所述过表达载体pCambia1300-221-HA用于调控拟南芥花期提前。进一步的：将基因REM16和带有XbaI和KpnI酶切位点的pCambia1300-221-HA载体分别进行KpnI和XbaI的双酶切，再按照基因片段和载体4：1的比例在T4连接酶的催化下进行16℃过夜连接20h制得。本专利技术提供了一种拟南芥基因REM16的基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0，所述基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:3所示，所述基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0用于调控拟南芥花期延迟。本专利技术还提供了拟南芥基因REM16在调控拟南芥开花期中的应用。进一步的：所述调控开花期的拟南芥中含有如序列表SEQIDNo:1所示的过表达载体pCambia1300-221-HA或如序列表SEQIDNo:2所示的基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0。进一步的：所述拟南芥基因REM16具有花期调控的功能，基因REM16过表达植株表现为早花性状，基因REM16沉默植株表现为晚花性状。进一步的：所述基因REM16过表达植株开花时间比野生型植株早4-6天，莲座叶数目比野生型少2片；而所述基因REM16沉默植株开花时间比野生型植株晚2-3天，莲座叶数目和野生型没有显著变化。进一步的：所述基因REM16过表达植株中涉及光周期途径GI、CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FT、LFY、AP1的表达量均高于野生型植株，春化途径FLC的表达量低于野生型植株，赤霉素途径RGA、RGL1的表达量与野生型比没有明显差异。进一步的：所述基因REM16沉默植株中涉及光周期途径GI、CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FT、LFY、AP1的表达量均低于野生型植株，春化途径FLC的表达量高于野生型植株，赤霉素途径RGA、RGL1的表达量与野生型比没有明显差异。本专利技术的优点和有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本专利技术通过花序侵染法的方法获得拟南芥基因REM16的过表达和基因沉默转基因载体及其转基因株系，通过研究过表达和基因沉默转基因植株表型，并将其与相同条件下生长的野生型植株开花时间及莲座叶数目进行比较。经过实验分析证明，拟南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期调控的功能，过表达REM16基因引起转基因拟南芥植株中开花相关基因表达变化而促进拟南芥提早开花，与野生型植株的开花时间相比表现为早花性状；沉默REM16基因引起转基因拟南芥植株中开花相关基因表达变化而延迟拟南芥开花，与野生型植株相比表现为晚花性状。通过分析转基因株系开花相关基因的表达从而确定REM16基因调控开花的功能。本专利技术的技术方案对于植物花期调控具有重要意义。附图说明图1为野生型与突变体REM16基因表达量分析（**：P<0.01）。图2为野生型与突变体开花时间及莲座叶比较，其中：(a)为野生型与突变体开花时间比较；(b)为野生型与突变体开花时间统计分析；(c)为野生型与突变体莲座叶数目统计分析(**：P<0.01)。图3为野生型与突变体开花相关基因表达量分析(**：P<0.01)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例来对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。本专利技术实验中用到的试剂等购自TAKARA、Promega、Sigma等公司。实验中用到的LB培养基配方：0.5%酵母粉、1%NaCl、1%蛋白胨。其它试剂配方：见《分子克隆》第三版。实施例1、REM16基因的克隆1、拟南芥的种植拟南芥种子的表面消毒：将50粒待灭菌的拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入1ml75%的乙醇（含有0.03%体积比的TritonX-100）震荡消毒1min，再用70%的乙醇震荡消毒1min（两次），最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入1/2MS培养基中，冰箱中4℃春化3d后取出置于光照培养箱中培养。培养条件如下：16h光照/8h黑暗交替光照，温度22℃，光强100μmol·m-2·s-1。然后，待光照生长7-10天将拟南芥幼苗移到土中，覆盖保鲜膜3-7天揭膜，后于培养室中培养，条件同光照培养箱。2、拟南芥总RNA提取(1)将拟南芥材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中；(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速加入1mlTrizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；(3)4℃，12,000rpm，离心11min，将0.8ml上清液转移到新的1.5ml离心管中；再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min直到分层。(4)4℃，12,000rpm，离心11min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中；再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，-20℃放置30mim。(5)4℃，12,000rpm，离心11min，弃上清，用0.9ml75%的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，12,000rpm，离心5min；(6)弃上清，开盖于超净工作台中干燥RNA约2-5min，加入40µlRNase-Free水，在60℃中充分溶解R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拟南芥基因

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥基因REM16的过表达载体pCambia1300-221-HA，其特征在于：所述过表达载体pCambia1300-221-HA的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:2所示，所述过表达载体含有如序列表SEQIDNo:1所示的基因REM16，所述过表达载体pCambia1300-221-HA用于调控拟南芥花期提前。2.根据权利要求1所述的拟南芥基因REM16的过表达载体pCambia1300-221-HA，其特征在于：将基因REM16和带有XbaI和KpnI酶切位点的pCambia1300-221-HA载体分别进行KpnI和XbaI的双酶切，再按照基因片段和载体4：1的比例在T4连接酶的催化下进行16℃过夜连接20h制得。3.一种拟南芥基因REM16的基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0，其特征在于：所述基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:3所示，所述基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0用于调控拟南芥花期延迟。4.拟南芥基因REM16在调控拟南芥开花期中的应用。5.根据权利要求4所述的拟南芥基因REM16在调控拟南芥开花期中的应用，其特征在于：所述调控开花期的拟南芥中含有如序列表SEQIDNo:1所示的过表达载体pCambia1300-221-HA或如序列表SEQIDNo:2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：董春海，乔龙飞，于延冲，荣永恒，崔宪奎，赵宇航，陈家才，侯晓敏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37