一种快速区分ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速区分ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测方法。本发明专利技术操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，区分不同类型的病毒。本发明专利技术方法具有良好的灵敏度、准确性、重复性和特异性，且使用简便快捷。与传统检测方法相比，本发明专利技术方法实现了对同一样本中的多种不同目的片段同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。

A method for rapid detection of ECT, MAD, MCMV, POLY multiplex fluorescent gene

The invention discloses a method for quickly distinguishing ECT, MAD, MCMV, POLY multiple fluorescent gene. The invention has the advantages of simple operation, through the PCR to obtain the target fragment, then the amplified products, fluorescent microspheres and hybrid encoding streptavidin avidin phycoerythrin, and then through the detector reads the MFI value to distinguish between different types of virus. The method of the invention has the advantages of good sensitivity, accuracy, repeatability and specificity, and is simple and convenient to use. Compared with the traditional detection method, the method of the invention realizes the simultaneous detection of a plurality of different target fragments in the same sample, the sample quantity is little, the operation is simple and fast, and the detection cost can be greatly reduced.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于实验动物的病毒检测领域，尤其涉及一种快速区分ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测方法。
技术介绍
鼠痘病毒（Mousepoxvirus），又称脱脚病病毒（Ectromeliavirus，ECT），可引起实验小鼠的烈性传染，分为急性和慢性两型，大部分为隐性感染。本病多呈爆发性流行，致死率极高，常造成全群淘汰，给科研、生产带来极大的危害，是清洁级小鼠必须检测的项目。小鼠腺病毒（MurineAdenovirus，MAD）是20世纪60年代从小鼠体内分离出来的一种最新的一种具双链DNA的动物病毒，分布十分广泛，容易导致呼吸道感染，如急性发热性咽喉炎、咽结膜热和肺炎等，是SPF级小鼠必要时需要排除的病原体。小鼠巨细胞病毒(MurineCytomegalovirus，MCMV)可导致小鼠肺炎，感觉神经性耳聋，眼内感染，心脏感染，脑炎，肝炎等。MCMV其致病性与机体免疫状态关系密切。在免疫抑制个体感染后可导致疾病甚至死亡，而免疫正常个体感染后一般为潜伏感染。目前我国标准对小鼠巨细胞病毒检测无要求，但是其感染应得到重视。小鼠巨细胞病毒感染对免疫学、肿瘤学、药理学、毒理学等试验结果会产生影响，因此有学者建议将MCMV作为SPF级动物应排除感染的病毒检测项目。小鼠多瘤病毒(MurinePolyomavirus，POLY）可使小鼠等动物产生各种组织肿瘤，隐性感染对实验动物本身造成危害，对科研工作造成潜在干扰，是SPF级小鼠必要时需排除的病原。鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒及小鼠多瘤病毒可混合感染，给病原的诊断和防治造成了困难，同时这四种病毒均对科研工作造成潜在干扰。目前ECT、MAD、MCMV、POLY的感染诊断方法主要是免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫酶试验（IEA）和免疫荧光试验（IFA）等，但是这些方法中不能应用于免疫功能低下或免疫缺陷动物如SCID小鼠、裸小鼠和裸大鼠等的检测，因为它们不能产生正常的抗体反应，此外，抗体检测方法不适用于病毒早期感染的诊断。抗原检测方面常规病毒分离鉴定方法复杂费时，不利于日常检测。普通PCR方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点，已成为实验动物病毒感染诊断的重要手段，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测。多重荧光基因检测方法是继平面芯片之后的一种新型芯片技术，有机整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果，具有自由组合、高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、无需洗涤、操作简便、在同一平台上即可完成蛋白质和核酸的检测等优点，实现了1个样品100种不同目的的分子进行检测，并能在30分钟内检测96份样品。被国际业界专家评价为临床诊断的趋势性技术之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速区分鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法及引物。本专利技术所采取的技术方案是：一种快速区分鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：ECT引物E1：5’-TACGGTGTATATGGCTACTCA-3’（SEQIDNO：1）；ECT引物E2：5’-ACTGCTGCTTCCTATACTCG-3’（SEQIDNO：2）；MAD引物A1：5’-AGACTCACACTGCGTATAGTCC-3’（SEQIDNO：3）；MAD引物A2：5’-CCAGAACTCGGTTATCCCCA-3’（SEQIDNO：4）；MCMV引物C1：5’-GCCCTCTTCATCCCTTACCT-3’（SEQIDNO：5）；MCMV引物C2：5’-GACCTCCATGTCCTTCATGC-3’（SEQIDNO：6）；。POLY引物P1：5’-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT-3’（SEQIDNO：7）；POLY引物P2：5’-TCAGTCAGCCATAGATGCAA-3’（SEQIDNO：8）。优选的，引物E1、A1、C1和P1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。优选的，引物E1的tag序列为：5’-CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-3’（SEQIDNO：9）；优选的，引物A1的tag序列为：5’-TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-3’（SEQIDNO：10）；优选的，引物C1的tag序列为：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’（SEQIDNO：11）；优选的，引物P1的tag序列为：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’（SEQIDNO：12）。优选的，引物E2、A2、C2和P2的5’端还添加有生物素标记。一种快速区分鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法，包括如下步骤：1）从样品中提取病毒DNA，以DNA为模板，加入上述引物进行PCR扩增；2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其病毒的类型。优选的，荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列能相应地与tag序列互补配对。优选的，步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：荧光编码微球20μL，链霉亲和素-藻红蛋白75μL，扩增产物5μL，总体积100μL。42℃反应30min。本专利技术的有益效果在于：可以同时对鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒进行检测，分辩不同类型的病毒，并且可以有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。与传统检测方法相比，本专利技术方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。附图说明图1是四种病毒质粒PCR的电泳图；图2是四种病毒质粒多重荧光基因检测方法检测实验结果图；图3是四种病毒质粒多重荧光基因检测方法检测灵敏度实验结果图；图4是四种病毒质粒多重荧光基因检测方法检测特异性实验结果图；图5是四种病毒样品多重荧光基因检测方法检测实验结果图。具体实施方式以下具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但不作为对本专利技术的限定。实例1鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒质粒的构建用试剂盒TIANampGenomicDNAKit分别提取ECT、MAD、MCMV和POLY病毒的DNA，分别以上述对应的引物，进行PCR扩增，扩增引物为：ECT引物E1：5’-TACGGTGTATATGGCTACTCA-3’（SEQIDNO：1）；ECT引物E2：5’-ACTGCTGCTTCCTATACTCG-3’（SEQIDNO：2）；MAD引物A1：5’-AGACTCACACTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速区分鼠痘病毒（ECT）、小鼠腺病毒（MAD）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）和小鼠多瘤病毒（POLY）的多重荧光基因检测方法的引物，其特征在于：所述引物是由ECT、MAD、MCMV、POLY的核心序列的上游序列和下游序列的互补序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种快速区分鼠痘病毒（ECT）、小鼠腺病毒（MAD）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）和小鼠多瘤病毒（POLY）的多重荧光基因检测方法的引物，其特征在于：所述引物是由ECT、MAD、MCMV、POLY的核心序列的上游序列和下游序列的互补序列组成。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：ECT引物E1：5’-TACGGTGTATATGGCTACTCA-3’（SEQIDNO：1）；ECT引物E2：5’-ACTGCTGCTTCCTATACTCG-3’（SEQIDNO：2）；MAD引物A1：5’-AGACTCACACTGCGTATAGTCC-3’（SEQIDNO：3）；MAD引物A2：5’-CCAGAACTCGGTTATCCCCA-3’（SEQIDNO：4）；MCMV引物C1：5’-GCCCTCTTCATCCCTTACCT-3’（SEQIDNO：5）；MCMV引物C2：5’-GACCTCCATGTCCTTCATGC-3’（SEQIDNO：6）；POLY引物P1：5’-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT-3’（SEQIDNO：7）；POLY引物P2：5’-TCAGTCAGCCATAGATGCAA-3’（SEQIDNO：8）。3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：引物E1、A1、C1和P1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于：所述引物E1的ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹雪琴，郭鹏举，黄韧，
申请(专利权)人：广东省实验动物监测所，
类型：发明
国别省市：广东;44