本发明专利技术公开了小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法。该方法利用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R对小菜蛾基因组DNA模板进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据测序色谱图鉴定小菜蛾个体钠离子通道在编码1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突变及其具体类型，一次性区分出所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。该方法具有快速简便、准确性高的优点，专用于小菜蛾对钠离子通道阻断剂(茚虫威和氰氟虫腙)抗性的监测和预警。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法，专用于小菜蛾对钠离子通道阻断类杀虫剂(SodiumChannelBlockingInsecticides，简称SCBIs，包括茚虫威和氰氟虫腙)靶标抗性的高灵敏度快速检测。技术背景小菜蛾作为世界性十字花科蔬菜和油菜害虫，全球每年造成的损失和防治费用高达40～50亿美元。十字花科蔬菜是世界各国食用蔬菜的主要来源，与人们日常生活息息相关；油菜是各国重要的油料作物，事关食用油产量安全。20世纪80年代中后期以来，小菜蛾在我国持续大面积暴发成灾，据统计近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。在长期的杀虫剂选择压力作用下，小菜蛾已对至少92种杀虫活性成分产生了不同程度的抗药性，几乎涵盖了所有用于其防治的杀虫剂。我国田间小菜蛾抗药性发展速度极快，并导致蔬菜农药残留超标严重威胁农产品质量安全，小菜蛾抗药性治理形势十分严峻。茚虫威是由美国杜邦公司20世纪末开发的第一个商品化的钠离子通道阻断型杀虫剂，已在中国、澳大利亚、美国等多个国家作为优良的候选杀虫剂登记注册。茚虫威在昆虫体内迅速转化为N-去甲氧碳基代谢物，它能更有效抑制电压门控钠通道进而阻断神经冲动传导。经过十多年使用，一些地区种群对茚虫威的抗性逐渐显现，部分使用较多地区的小菜蛾种群对其已产生极高水平抗性。氰氟虫腙是德国巴斯夫公司和日本农药公司联合开发的一种全新的化合物，其不需要生物激活本身具有杀虫活性，也属于神经元钠离子通道阻断剂。目前，昆虫中报道甜菜夜蛾对氰氟虫腙产生了较强的抗药性。茚虫威和氰氟虫腙同属钠离子通道阻断类杀虫剂，而钠离子通道基因突变是导致抗性产生的最主要原因。至今，国内外尚未建立昆虫对SCBIs类杀虫剂抗性的分子检测方法，基于该靶标基因的分子检测技术均集中在DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂相关的突变位点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中小菜蛾对钠离子通道阻断类杀虫剂抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾SCBIs类杀虫剂抗药性机理的研究，提供小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检测方法，所述的钠离子通道阻断剂为茚虫威和氰氟虫腙，利用SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R对小菜蛾基因组DNA模板进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据测序色谱图鉴定小菜蛾个体钠离子通道编码1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突变及其具体类型，一次性区分出所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。本专利技术涉及的小菜蛾野生型钠离子通道基因cDNA序列全长5850bp(GenBank登录号为KM027335)，我们研究发现：敏感型序列ROTH-S第5534位核苷酸由T突变为A(附图1：SCBIs-R2，GenBank登录号为KM027337)，其编码的蛋白质由F突变为Y，将导致小菜蛾对钠离子通道阻断剂茚虫威和氰氟虫腙产生抗性；敏感型序列ROTH-S第5542位核苷酸由G突变为A(附图1：SCBIs-R1，GenBank登录号为KM027336)，其编码的蛋白质由V突变为I，将导致小菜蛾对钠离子通道阻断剂茚虫威和氰氟虫腙产生抗性。所述的根据直接测序色谱图准确鉴定小菜蛾个体钠离子通道1845和1848位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分出两个位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：小菜蛾钠离子通道基因5534位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′前一位)为T单峰、5542位碱基(即色谱图识别序列5′-CCTCATC-3′后一位)为G单峰，则表明该小菜蛾个体为不携带钠离子通道突变的敏感纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的纯合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸突变的纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的纯合子。说明书中所述的F1845Y表示第1845位氨基酸发生由F到Y的突变，V1848I表示第1848位氨基酸发生由V到I的突变。所述的分子检测方法，优选包含以下步骤：(1)提取单头小菜蛾幼虫或成虫的基因组DNA；(2)利用SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；(3)将上一步获得的PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收后进行直接测序，测序引物为SEQIDNO.2所示的引物R，通过检测编码1845和1848位氨基酸的核苷酸测序色谱图，一次性区分在这两个位点分别或同时携带所述钠离子通道阻断剂抗性基因的个体。其中PCR反应体系25ul：12.5ul2xGCBufferI，1.25ULATaqDNA聚合酶,1ul单头小菜蛾样本的基因组DNA，1ul10mMdNTPs，10mM的引物各1ul，加双蒸水至反应总体积为25ul；PCR反应程序：94℃预变性3min，然后循环数为35：94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸10min。用于分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的引物对，由SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R组成。一种用于检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的试剂盒，包含本专利技术所述的引物对。本专利技术所述的引物对在分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性中的应用。本专利技术所述的试剂盒对在分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性中的应用。有益效果专利技术人研究发现小菜蛾钠离子通道第4结构域第6跨膜片段的F1845Y和V1848I突变与茚虫威和氰氟虫腙抗性相关，且在我国多个田间种群中可以检测到不同频率的等位基因突变情本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检测方法，所述的钠离子通道阻断剂为茚虫威和氰氟虫腙，其特征在于利用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R对小菜蛾基因组DNA模板进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据测序色谱图鉴定小菜蛾个体钠离子通道编码1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突变及其具体类型，一次性区分出所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。
【技术特征摘要】
1.一种小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检测方法，所述的钠离
子通道阻断剂为茚虫威和氰氟虫腙，其特征在于利用SEQIDNO.1所示的特异性
正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R对小菜蛾基因组DNA模板进
行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据测序色谱图鉴定小菜蛾个体钠离子
通道编码1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突变及其具体类型，一次性区分出
所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。
2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于所述的根据测序色谱
图鉴定小菜蛾个体钠离子通道编码1845和1848位氨基酸的密码子是否突变及其
具体类型，一次性区分出所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂
合子和抗性纯合子的具体方法为：色谱图中识别序列前一位为T单峰、识别序列
后一位为G单峰，则表明该小菜蛾个体为不携带钠离子通道1845和1848位氨基
酸突变的钠离子通道阻断剂敏感纯合子；色谱图中识别序列前一位为T/A双峰、
识别序列后一位为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带1845位氨基酸由F突变
为Y的钠离子通道阻断剂抗性杂合子；色谱图中识别序列前一位为A单峰、识别
序列后一位为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带1845位氨基酸由F突变为Y
的钠离子通道阻断剂抗性纯合子；色谱图中识别序列前一位为T单峰、识别序列
后一位为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为携带1848位氨基酸由V突变为I的
钠离子通道阻断剂抗性杂合子；色谱图中识别序列前一位为T单峰、识别序列后
一位为A单峰，则表明该小菜蛾个体为携带1848位氨基酸由V突变为I的钠离
子通道阻断剂抗性纯合子；色谱图中识别序列前一位为T/A双峰、识别序列后一
位为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带1845位氨基酸由F突变为Y和
1848位氨基酸由V突变为I双突变的钠离子通道阻断剂抗性杂合子；色...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴益东，王兴亮，杨亦桦，武淑文，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。