一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其中，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。本发明专利技术利用多形微眼藻的特异性引物通过荧光定量PCR技术对海水中的多形微眼藻进行检测，在确保准确性的基础上，不仅提高了灵敏度，而且实现了样品在短时间内进行大批次处理的目的，大大缩短了工作时间，为实现对多形微眼藻进行快速、准确的定性定量研究提供了强大的工具。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及海洋浮游植物检测的
，特别涉及多形微眼藻荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
：浮游生物包括浮游植物和浮游动物两大类。浮游生物个体小，生活周期短，繁殖速度快，对环境的变化十分敏感，对水体的营养状态的变化能够迅速地做出反应。在水质好的水域，浮游生物的多样性指数及均度指数均较大；反之，浮游生物的种类多样性下降，分布呈现不均匀的情况。浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性增殖或聚集在一起而已发赤潮现象。赤潮发生时会有大量的鱼类和贝类死亡，导致重大的经济损失和严重的海洋生态灾难，毒素还会富集在贝类和鱼类的体内，人类使用后会引发疾病。为预防赤潮的发生，需要对水体中藻类进行种类和数量检测，现阶段针对藻类的荧光定量PCR检测方法较多，如中国专利公开号，CN101906467A公开了一种荧光定量PCR检测微小原甲藻的方法，包括：(1)藻液的预处理抽取海域中的样品藻液，离心收集细胞，然后用pH7.0的PBS缓冲液洗涤两次后重悬，制成密度为2.5×108cell/L的待处理藻液；(2)荧光定量PCR引物及浓度优SYBR法的荧光定量引物序列为：PM-1iF：CCCCCATGCAGAGACTCAA，PM-1iR：CAGCAAGGACAGGCACAGAA；引物终浓度为：200nmol/L；(3)微小原甲藻的细胞个数和基因组DNA检测取步骤(1)中得到的待处理藻液于离心管中，在冰浴中进行超声波处理，显微镜观察直至所有细胞均被破碎，将藻液按1：10倍稀释，5个稀释度，每个稀释度重复3次，然后进行荧光定量PCR扩增，计算得出微小原甲藻的细胞个数。再如中国专利公开号CN102392076A公开了一种产2-MIB蓝藻的PCR定性和TaqMan荧光定量PCR定量的检测方法，其步骤是：A、采集待测水样，经0.45μm的醋酸纤维素膜过滤，将过滤到的藻进行总基因组DNA的提取和纯化，将提取到的DNA溶于无菌双蒸水中，置-20℃保存；B、定性PCR的反应体系为：2×PCR反应体系10μl，特异性扩增2-MIB合成相关单萜环化酶基因的正反引物各1μl，待检测的DNA1μl，以双蒸水校正至20μl体积，所用引物为：CITf5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3，CITr5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3，以产2-MIB蓝藻DNA为阳性对照，双蒸水为阴性对照；C、定性PCR的反应程序为：94℃预变性3min，接着40个循环，每个循环94℃30s、58℃30s和72℃30s，循环过后最后72℃延伸5min；D、定性PCR产物和阳性对照、阴性对照一起进行2％w/w琼脂糖凝胶电泳，电泳过后溴化乙锭染色，紫外灯下观测，目标条带长度为206bp。现有技术中，根据藻类不同建立不同的引物设计和对应性的检测方法，现有技术中少有针对多形微眼藻检测的记载，如《中国海洋大学学报》2015年3月公开的渤海海域褐潮期微型浮游生物多样性的初步研究，作者：于杰，张玲玲，孙妍等，其公开了检测时可变区V-的扩增及产物3′末端加A利用18rsDNA，V9区通用引物V9F（5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′）和V9R（5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′），扩增可变区V9：这种检测方法，发现了除抑食金球藻外的另一种优势藻－多形微眼藻，该藻属硅藻门、微眼藻属，长2.1-3.4μｍ，细胞呈圆形、近圆形或长椭圆形。褐潮爆发期间多形微眼藻丰度较高这一现象，褐潮爆发后，除抑食金球藻外，还伴随中肋骨条藻、假微型海链藻和多形微眼藻的增长。多形微眼藻能降低海湾扇贝幼虫的生长率，与渤海海域褐潮期观察到的海湾扇贝幼虫的滞长现象一致。综合以上研究结果，抑食金球藻和多形微眼藻在褐潮海域均有分布，且二者在光镜下大小相近，形态相似，都能抑制海湾扇贝的生长，研究发现二者在褐潮爆发时可大量共存。由此推测，渤海海域褐潮可能是由抑食金球藻和多形微眼藻共同作用而成。因此，研究一种针对多形微眼藻的检测方法简便，灵敏度高，准确率高，有效区别多形微眼藻与其他藻类的多形微眼藻荧光定量PCR检测方法。
技术实现思路
：本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种针对多形微眼藻的检测方法简便，灵敏度高，准确率高，有效区别多形微眼藻与其他藻类的多形微眼藻荧光定量PCR检测方法。为实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其中，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18SrDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18SrDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。步骤E中多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计为：MpF（5’-TTAGATAGAAACCAACCCTC）MpR（5’-ATACCCTACCATCCAAAG）。步骤F、多形微眼藻18SrDNA质粒标准品制备：以多形微眼藻DNA为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110V、35min，收集目的片段处的凝胶，选用小量胶回收试剂盒回收目标DNA片段，然后进行连接、转化和培养，通过蓝白斑筛选得到目的基因的阳性克隆，将阳性克隆接种到LB液体培养基中，放到37℃摇床中过夜培养，取部分菌液送测序公司测序。若验证为阳性克隆，用质粒提取纯化试剂盒提取质粒，制作多形微眼藻18SrDNA质粒标准品。步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立-多形微眼藻质粒标准曲线的绘制：用核酸蛋白分析仪测得多形微眼藻质粒标准品的浓度为175.9ng/μL，根据质粒浓度与基因拷贝数之间的关系公式：拷贝浓度（copy/μL）=(Con×6.02×1014)/(碱基对×660)，计算得到质粒标准品中18SrDNA的拷贝浓度为1.28×1012copy/μL，对质粒标准品做10倍梯度稀释，获得拷贝浓度为1.28×109、1.28×108、1.28×107、1.28×106、1.28×105、1.28×1041.28×103、1.28×102copy/μL的梯度稀释样品，作为荧光实时定量PCR的梯度标准品，放入-80℃冰箱保存待用，用德国罗氏（Roche）公司的FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)试剂盒，以MpF和MpR为引物，上述8个稀释浓度的样品为模板，进行实时荧光定量PCR，每个稀释浓度样品做三个平行样，外加一个阴性对照，以样品18SrDNA基因拷贝数对数值（以10为底）为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制质粒标准曲线，标准方程为y=-2.8792x+39.255（R2=0.989），其中y为Ct值，x为质粒拷贝数以10为底的对数值；步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立-多形微眼藻细胞标准曲线的绘制：收集6.6×107个多形微眼藻细胞，提取其DNA，最终使1μL溶液中DNA量相当于1.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞‑质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。

【技术特征摘要】
1.一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18SrDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18SrDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。
2.根据权利要求1所述多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤E中多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计为：
MpF（5’-TTAGATAGAAACCAACCCTC）
MpR（5’-ATACCCTACCATCCAAAG）。
3.根据权利要求1所述多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤F、多形微眼藻18SrDNA质粒标准品制备：以多形微眼藻DNA为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110V、35min，收集目的片段处的凝胶，选用小量胶回收试剂盒回收目标DNA片段，然后进行连接、转化和培养，通过蓝白斑筛选得到目的基因的阳性克隆，将阳性克隆接种到LB液体培养基中，放到37℃摇床中过夜培养，取部分菌液送测序公司测序；若验证为阳性克隆，用质粒提取纯化试剂盒提取质粒，制作多形微眼藻18SrDNA质粒标准品。
4.根据权利要求1所述多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立-多形微眼藻质粒标准曲线的绘制：用核酸蛋白分析仪测得多形微眼藻质粒标准品的浓度为175.9ng/μL，根据质粒浓度与基因拷贝数之间的关系公式：拷贝浓度（copy/μL）=(Con×6.02×1014)/(碱基对×660)，计算得到质粒标准品中18SrDNA的拷贝浓度为1.28×1012copy/μL，对质粒标准品做10倍梯度稀释，获得拷贝浓度为1.28×109、1.28×108、1.28×107、1.28×106、1.28×105、1.28×1041.28×103、1.28×102copy/μL的梯度稀释样品，作为荧光实时定量PCR的梯度标准品，放入-80℃冰箱保存待用，用德国罗氏（Roche）公司的FastStartUniversalSYBRGr...

【专利技术属性】
技术研发人员：甄毓，乔玲，米铁柱，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37