一种维生素B2的生物电化学检测方法技术

本发明专利技术属于生化检测技术领域，具体涉及一种维生素VB2的生物电化学检测方法；该检测方法在于使用希瓦氏菌的电子受体、希瓦氏菌菌液和pH缓冲溶液共同组成反应液体系，采用三电极系统，控制一定的电位，将含有VB2的样品加入到生物电化学传感器的反应液中，检测电流值的变化；根据VB2的浓度变化和电流响应值变化之间的线性关系来计算测定样品中VB2的浓度；该检测方法不依赖大型仪器设备，检测成本低、操作简单、准确性高、专一性强，可应用于生化样品、食品、药品中VB2的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种维生素B2的生物电化学检测方法，属于生化检测

技术介绍
维生素B2，VB2，即核黄素，化学式为C17H20N4O6。它是一种水溶性B族维生素，在机体的碳水化合物、蛋白质及脂肪的能量转化过程中起着重要作用，对人类健康有着重要意义。VB2缺乏会引起人体代谢障碍，从而引发多种病变。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等。值得注意的是，人体自身不能合成VB2，只能通过膳食中获取。因此，VB2含量是评估食品营养及其功能性的重要指标。同时，由于VB2缺乏是一种常见病症，所以VB2成为相关药品及保健品的重要成分，其含量也常被作为这类商品的重要质量指标。综上，VB2含量的快速、准确测定在VB2的合成及其相关的食品、药品及保健品行业生产中有重要意义。现有的VB2检测方法包括微生物法、荧光分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、以及质谱法。微生物法是国标法中常采用的一种检测VB2方法，其原理即某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素，在一定条件下，该细菌的生长情况及代谢产物与该维生素的含量成正比，以此来测定某一维生素的含量。王光亚在《食物中核黄素测定方法的比较》一文中（生理科学，1988,8:419-420）指出微生物法其特异性和灵敏度较高，但是方法费时，周期较长，给实际测定过程带来不便。荧光分光光度法是目前应用较广泛的一种VB2检测方法。该方法利用VB2在pH4~9、440~500nm激发光照射下产生黄绿色荧光的特性，根据荧光强度与VB2浓度成正比的原理对VB2进行定量测定。宋吉英在《荧光分光光度法测定枸杞中核黄素含量》一文中（化学世界，2012,12:720-722）报道了使用荧光分光光度法测定了枸杞中的VB2的研究方法。该方法简便、快速,但由于食物中的荧光杂质较多，干扰测定，该方法仅适用于含VB2较高干扰较少的乳类，故局限了其应用发展。HPLC测定方法是根据样品中各种物质在色谱柱中分离系数的不同，将其同样品中干扰物分开，并根据目标检测物的分子特性选择对应的检测器进行定性定量检测。VB2的测定通常采用荧光检测器，C18色谱柱，激发波长440nm，发射波长在525nm左右。邓洁熊等人在《HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量》文章中（广东药学院学报，2006,2（1）：53-54）报道了核黄素磷酸钠中VB2含量的HPLC测定方法。该方法相对简单、快速、重复性好，但是对仪器有较高要求，样品处理较为繁琐。质谱法是纯物质鉴定的最有力工具之一，利用电场和磁场将运动的离子，按它们的质荷比分离后进行检测的方法。Mandal等人在《RapiddeterminationofvitaminB2andB12inhumanurinebyisocraticliquidchromatography》一文中（AnalyticaChimicaActa,2009,640:110-113）报道了分别利用高效液相色谱法和基质辅助激光解吸电离质谱法测定人类尿液中的VB2含量。然而在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作，十分麻烦，并且质谱仪属于大型昂贵仪器，检测成本高。生物电化学传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。在特定电位控制条件下，希瓦氏菌可以在自身的富马酸还原酶(SelenitereductionbyShewanellaoneidensisMR-1ismediatedbyfumaratereductaseinperiplasm，SCIENTIFICREPORTS，2014,4:3725，DOI:10.1038/srep03735）的催化作用下，利用来源于胞外电极的电子还原富马酸，并在外电路形成电流。而VB2是希瓦氏菌实现该细胞内外电子转移过程的电子中介体，其浓度高低与该过程的电子转移效率即外电路电流强度大小直接相关。因此，可以直接通过反应体系的电流变化来高效、快速检测样品中得VB2并测定其浓度，本专利技术基于此构建了一种新型的VB2生物电化学检测方法，经过对现有技术的检索，并未发现有利用生物电化学方法检测VB2的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的专一性测定VB2的方法，解决现有技术中存在的检测成本高、检测仪器昂贵、数据重复性差、操作过程（包括制备样品及样品预处理等过程）复杂的问题。本专利技术的技术方案是：一种维生素B2的生物电化学检测方法，按以下步骤进行操作：(1)将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行培养，活化菌体；(2)将活化的希瓦氏菌菌液离心，按一定比例将离心后的沉淀加入到反应缓冲溶液中；(3)将参比电极、工作电极、对电极安装在含有步骤（2）得到的溶液的装置中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；(4)在步骤（3）得到的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，待电流输出稳定后，向系统中加入希瓦氏菌的电子受体；(5)待电流输出稳定，向三电极系统中加入VB2样品，检测并记录电流变化值。其中希瓦氏菌（Shewanellaoneidensis），购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；将保存的希瓦氏菌接种至培养基进行培养，获得活化的菌体。其中反应缓冲液（参考：Awhole-cellelectrochemicalbiosensingsystembasedonbacterialinwardelectronflowforfumaratequantification.Rong-WeiSi,Dan-DanZhai,Zhi-HongLiao,LuGao,Yang-ChunYong.BiosensorsandBioelectronics68(2015)34–40）由以下物质组成，LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/LpH=7；M9培养基：Na2HPO4.12H2O17.8gL-1、KH2PO43gL-1、NaCl0.5gL-1、NH4Cl10.5gL-1、18mM乳酸钠、0.1mM的CaCl2和1mM的MgSO4。其中，步骤（2）中所述的希瓦氏菌沉淀加入到反应缓冲溶液中，其OD值控制在1.5-2之间；步骤（3）中参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；工作电极为碳毡或...

【技术保护点】
一种维生素B2的生物电化学检测方法，其特征在于，按以下步骤进行操作：（1）将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行培养，活化菌体；（2）将活化的希瓦氏菌菌液离心，按一定比例将离心后的沉淀加入到反应缓冲溶液中；（3）将参比电极、工作电极、对电极安装在含有步骤（2）得到的溶液的装置中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；（4）在步骤（3）得到的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，待电流输出稳定后，向系统中加入希瓦氏菌的电子受体；（5）待电流输出稳定，向三电极系统中加入VB2样品，检测并记录电流变化值。

【技术特征摘要】
1.一种维生素B2的生物电化学检测方法，其特征在于，按以下步骤进行操作：
（1）将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行培养，活化菌体；
（2）将活化的希瓦氏菌菌液离心，按一定比例将离心后的沉淀加入到反应缓冲溶液中；
（3）将参比电极、工作电极、对电极安装在含有步骤（2）得到的溶液的装置中，连接信号
检测系统，组成生物电化学传感器；
（4）在步骤（3）得到的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，待电流输出稳定
后，向系统中加入希瓦氏菌的电子受体；
（5）待电流输出稳定，向三电极系统中加入VB2样品，检测并记录电流变化值。
2.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述
的希瓦氏菌沉淀加入到反应缓冲溶液中，其OD值控制在1.5-2之间。
3.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（3）中参比
电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；工作电极为碳毡或碳布；对电极为铂丝电极。
4.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述
的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成。
5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍阳春，司荣炜，翟丹丹，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32