一种细胞保存液及其在流式样本保存中的应用制造技术

本发明专利技术提供了细胞保存液在流式细胞仪检测中的应用，其中检测是白血病和淋巴瘤分型，细胞保存液包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂。另外，本发明专利技术还公开了一种细胞保存液的制备方法以及流式细胞样本的保存方法。该细胞保存液可用于临床细胞标本的长期稳定保存，尤其对于流式细胞样本，具有长期稳定的保存效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，具体而言，本专利技术涉及用流式细胞仪检测的含细胞样本的保存方法。
技术介绍
随着生物、医学技术的发展，科研检测、临床诊断已逐渐上升至细胞、基因水平，作为单细胞或生物离子定量分析重要手段之一的流式细胞技术的应用也日益广泛。流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。包括本专利技术人的中国专利第201610027214号在内的许多现有技术着重对流式细胞术本身的步骤和参数进行了研究。然而，现有技术对于进行流式细胞检测的样本及其保存/处理方法的研究较少。美国专利US5753428A公开了一种细胞保存液，然而本专利技术人发现，由于其中使用了柠檬酸根等物质，使得对血液样本上的CD33、CD13等标记不稳定，用其保存的样本时间稍长，进行如中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，将产生与原始样本检测不同的结果。国内对此的研究也很少，例如中国专利第201410534999号公开了一种稳定血液样品细胞的试剂，尽管其声称可用于流式细胞仪检测，但是作为业内人士，其中使用了具有强细胞毒性和强氧化锌的重铬酸钾，其保存效果还不如目前常用的含多聚甲醛的细胞保存液。本专利技术人发现，尤其是本专利技术人的中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，其涉及抗体对结果的判读，因此如果不能及时进行检测，或者采用合适方式处理样本，都会造成抗原表达强度发生不成比例的下降，从而使结果准确度大大降低，甚至可以造成白血病/淋巴瘤免疫分型病例的误诊。为此，本专利技术人在持续的研究下，开发出了一种细胞保存液，可稳定保存样本至少49天，保证长期保存的骨髓、外周血、组织等标本的质量，从而保证免疫分型、淋巴细胞亚群检测等多种白细胞相关检测的结果稳定和正确，特别适用于中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，实现样本采集和检测分离，采集时无需考虑检测仪器和试剂，为集约化检测奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供新的细胞保存液及其制备方法。另外，本专利技术还涉及基于该细胞保存液的保存含有细胞的样本的方法、保存产物以及在流式细胞术中的应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了细胞保存液，其pH7.2～7.5，其中溶质包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂。其中，可以包括抗凝剂，也可以不包括抗凝剂。通常不包括抗凝剂的细胞保存液保质期更长一些，适合大批量存储，待分装时再加入抗凝剂。细胞保存液由溶质和溶剂组成，其中溶剂通常是水，优选是纯水。优选在本专利技术第一方面的细胞保存液中，溶质由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂组成。抗凝剂通常可以是肝素和/或EDTA。由于EDTA更适合中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，因此优选在本专利技术第一方面的细胞保存液中，抗凝剂是EDTA或其盐，如钾盐(即EDTA-K2)。优选在本专利技术第一方面的细胞保存液中，每种组分的含量如下：Na2HPO410mmol/L、KH2PO42mmol/L、NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、聚乙二醇10-20％(wt)、氯化铬0.1％-1％(wt)。如果本专利技术第一方面的细胞保存液包括抗凝剂，则优选其中，细胞保存液中抗凝剂的含量为15～22g/L。本专利技术的细胞保存液没有腐蚀性，也没有氧化性，可以装于多种材质的容器，如玻璃容器或塑料容器。在第二方面，本专利技术提供了本专利技术第一方面的细胞保存液的制备方法，其包括将Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂混合的步骤。优选本专利技术第二方面的制备方法还包括混合后进行过滤和/或分装的步骤。对于不加抗凝剂的细胞保存液来说，通常可以不分装，直接装于大试剂瓶中储存；对于加抗凝剂的细胞保存液来说，优选进行分装，这样可以直接加入采集的含细胞的样本而进行保存。分装可以分装在非真空管中，也可以分装在真空管中。鉴于通常血液样本的采集体积为1～2ml，因此分装的体积对应为100～300μl/管，优选为200μl/管。在第三方面，本专利技术提供了保存含有细胞的样本的方法，其包括：(1)提供含有细胞的样本液；(2)任选将抗凝剂与所述样本液混合；(3)将本专利技术第一方面的细胞保存液与所述样本液混合，其中所述细胞保存液与所述样本液的体积比≥1:10；(4)将步骤(3)获得的混合物保存。含有细胞的样本液可以本身就是液体，如，血液、骨髓，这样提供该样本液本身即可。含有细胞的样本液本身可以是组织或细胞沉积，这样需要将组织中的细胞分离或将细胞沉积分散，形成细胞悬浮液，从而进行提供。如果本专利技术第一方面的细胞保存液不含抗凝剂，则需向该细胞保存液中加入抗凝剂(如，EDTA或其盐)，优选加入抗凝剂至其含量达到1.5～2.2mg/ml。如果本专利技术第一方面的细胞保存液包含抗凝剂，则无需实施本专利技术第三方面的方法中的步骤(2)。优选在本专利技术第三方面的方法中，在步骤(3)中，所述细胞保存液与所述样本液的体积比为1：5～10。步骤(3)获得的混合物可以于室温(如25℃)保存，优选于2～8℃保存，这样可以有更长的保存期。优选保存期为3天以上，更优选为5天以上，进一步优选为10天以上，如保存期为15天、30天或49天。在第四方面，本专利技术提供了本专利技术第三方面的方法获得的保存产物，优选其为保存了3天以上的保存产物，更优选其为保存了5天以上的保存产物，进一步优选其为保存了10天以上的保存产物，如保存了15天、30天或49天的保存产物。在第五方面，本专利技术提供了本专利技术第四方面的保存产物在用流式细胞仪检测的方法中的应用；相应地，本专利技术也提供了本专利技术第四方面的保存产物在制备用于用流式细胞仪检测的方法的试剂盒。优选在本专利技术第五方面的应用中，所述用流式细胞仪检测的方法是白血病和淋巴瘤分型的方法。更优选在本专利技术第五方面的应用中，优选所述白血病和淋巴瘤分型的方法是在中国专利第201610027214号所述方法基础上的白血病和淋巴瘤分型的方法，其包括：(1)进行本专利技术第三方面的方法；(2)将步骤(1)的方法获得的保存产物等分，分别与由抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体组成的抗体组合物和由抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体组成的抗体组合物混合入两根流式管，混匀后孵育；(3)向步骤(2)孵育的两根流式管加入红细胞裂解液，混匀后孵育，离心，去上清并重悬；和，(4)四色流式细胞仪检测步骤(3)重悬的两根流式管，并计算结果。进一步优选其中，计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光结果：CD33vsCD13、CD33vsCD7、CD7vsCD13、CD117vsCD34、CD117vsCD19和CD19vsCD34。也进一步优选其中，白血病和淋巴瘤是多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病M3型、急性髓细胞白血病M5型、边缘带淋本文档来自技高网...

【技术保护点】
细胞保存液，其pH7.2～7.5，其中溶质包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂，优选由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂组成。

【技术特征摘要】
1.细胞保存液，其pH7.2～7.5，其中溶质包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂，优选由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂组成。2.权利要求1所述的细胞保存液，其中抗凝剂是EDTA或其盐(如钾盐)。3.权利要求1所述的细胞保存液，每种组分的含量如下：Na2HPO410mmol/L、KH2PO42mmol/L、NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、聚乙二醇10-20％(wt)、氯化铬0.1％-1％(wt)，进一步优选抗凝剂的含量为15～22g/L。4.权利要求1～3之一所述的细胞保存液的制备方法，其包括将Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂混合的步骤，进一步优选包括混合后进行过滤和/或分装(如分装成200μl/管)的步骤。5.保存含有细胞的样本的方法，其包括：(1)提供含有细胞的样本液(如，血液、骨髓或细胞悬浮液)；(2)任选将抗凝剂与所述样本液混合；(3)将权利要求1～3之一所述的细胞保存液与所述样本液混合，其中所述细胞保存液与所述样本液的体积比≥1:10，如为1:5～10；(4)将步骤(3)获得的混合物保存(优选于2～8℃保存)，优选保存期为3天以上，更优选为5天以上，进一步优选为10天以...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪万茂，
申请(专利权)人：浙江博真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33