本发明专利技术公开了一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性与稳定性的方法，具体包括：获得变异位点；确定待测水稻品种的测试区域；构建数据库；确定抽样量后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA；制备引物；利用引物对混合样本的DNA进行扩增，扩增产物用于构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析测序片段组，获得待测水稻品种基因型和杂株基因型；比较获得近似品种、变异位点和变异位点率；将杂株基因型与数据库中的基因型比较，获得杂株品种后，计算杂株率；利用变异位点、变异位点率和杂株率，判断待测水稻品种特异性、一致性和稳定性。该方法能够准确、完整地判断待测水稻品种的特异性、稳定性与一致性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性 与稳定性的方法。
技术介绍
作为一种特化的知识产权，植物新品种已经成为一个公司及至一个国家的核心竞 争力。植物新品种授权与相关法律问题的解决依赖于DUS测试，即对待测水稻品种的特异 性（Distinctness)、一致性（Uniformity)和稳定性（Stability)的田间种植鉴定或室内分 子标记鉴定。田间种植鉴定流程为：将待测水稻品种与近似品种同时植于田间，在2年及以 上的生长季节内，观察它们的多个性状，根据性状表现判断待测水稻品种与近似品种的差 异显著性，即特异性，同时判断群体内杂株比例，即一致性和稳定性；室内分子标记鉴定的 流程为：分单株提取待测水稻品种与近似品种中每个样本的DNA，并分别对每个样本的每 个测试区域进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应），并对每个PCR产物进 行电泳或一代测序检测，根据检测结果，获得待测水稻品种与近似品种的差异位点比例，根 据差异位点比例，判断待测水稻品种的特异性。 田间种植鉴定的缺点是：周期长、工作量大，环境影响性状，导致判断不准确。室内 分子标记鉴定的缺点是：需要分别处理每个样本的每个测试区域，工作量大，不能对样本与 测试区域大量抽样，无法计算杂株率，因而无法进行稳定性与一致性的测试。田间种植鉴定 与室内分子标记鉴定的共同缺点是：均由于工作量的原因，无法从现有品种中客观选择近 似品种，只能由品种权申请人提供，而基于商业利益等动机，品种权申请人提供的近似品种 可能不真实，从而造成错误品种授权的法律后果。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术实施例提供了一种测试纯系水稻新品种的特 异性、一致性与稳定性的方法。所述技术方案如下： 本专利技术实施例提供了一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性与稳定性的方 法，所述方法包括： 获得不同水稻品种间的变异位点； 通过所述变异位点确定待测水稻品种的测试区域，所述测试区域包括通用测试区 域，至少部分所述变异位点包含在所述通用测试区域内； 构建包含所述待测水稻品种在所有所述测试区域的基因型的数据库； 确定所述待测水稻品种的抽样量SN后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA ; 制备扩增所述测试区域的引物，所述引物包括通用测试区域引物； 利用所述引物对所述混合样本的DNA进行扩增，得到所述测试区域的扩增产物， 所述扩增产物用于构建高通量测序文库； 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组； 分析所述测序片段组，获得待测水稻品种基因型和杂株基因型； 将所述待测水稻品种基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得 所述待测水稻品种的近似品种、变异位点和变异位点率； 将所述杂株基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得杂株品种 后，计算杂株率； 利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测水稻品种特异 性、一致性和稳定性。 具体地，所述抽样量5抑茜足如下条件出預0^1阶^]?，0.95)/5^^彡1.15柳，其中 ΒΙΝ0Μ. INV为excel 2010中的函数，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值，所述抽 样量SN的公式含义为：即使所述杂株率只超出一致性和稳定性时的判断阈值M的15%，所 述抽样量在95%的概率保证下，可正确判断所述待测水稻品种的稳定性与一致性。 具体地，所述高通量测序的深度CF满足如下条件：BIN0M.DIST(10, ΙΟ,ΒΙΝΟΜ. DIST (8, 20, ΒΙΝ0Μ. DIST (0, CF, 0.1 % , TRUE), TRUE), FALSE) ^ 99.9 %,1-ΒΙΝΟΜ. DIST(10000, 10000, 1-ΒΙΝ0Μ. DIST(8, 20, 1-ΒΙΝ0Μ. DIST(99. 99%*CF,CF, 99. 9989% , TRUE) ，TRUE)，FALSE)彡 0· 1%且 ΒΙΝΟΜ. DIST(10*(1-M)*CF, 10*CF, 1-110% *Μ, TRUE)彡 95. 0%， 其中，CF为所述高通量测序的深度，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值，BIN0M. DIST为excel 2010中的函数，所述高通量测序的深度CF的公式的含义为：在所述杂株 率低至0. 1%、所述杂株品种为10个且所述杂株品种与所述待测水稻品种间平均仅有20 个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的检出全部所述杂株品种的概率 多99. 9% ;在所述数据库的品种为10000个且所述杂株品种与所述待测水稻品种间平均仅 有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的存在误判所述杂株品种的 概率< 0. 1% ;在所述杂株品种为10个且真实杂株率仅超过判断特异性时所选用的阈值 的10%时，由所述高通量测序的深度CF决定的对稳定性与一致性的判定结论正确的概率 彡 95. 0%〇 具体地，所述测试区域还包括非通用测试区域，所述引物还包括非通用测试区域 引物。 进一步地，所述非通用测试区域引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物包 括第一正向引物和第一反向引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述 第一引物和所述第二引物分别进行单独扩增得到两个所述非通用测试区域的扩增产物，将 两个所述非通用测试区域的扩增产物等量混合用于构建单独扩增的高通量测序文库； 所述第一正向引物的5'端连接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1，所述第 一反向引物中的5'端连接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2 ; 所述第二正向引物的5'端连接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2,所述第 二反向引物的5'端连接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1。 进一步地，利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测品种 特异性、一致性和稳定性的方法包括： 当所述变异位点率多SD或所述非通用测试区域存在所述变异位点时，所述待测 水稻品种具有特异性，当所述变异位点率< SD且所述变异位点不存在于所述非通用测试 区域中时，所述待测水稻品种不具有特异性，其中，SD为判断特异性时所选用的阈值； 当所述待测水稻品种的所述杂株率< M时，所述待测水稻品种具有一致性和稳定 性，当所述待测水稻品种的杂株率大于> M时，所述待测水稻品种不具有一致性和稳定性， M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值； 所述杂株率R = R1+R2-R3-R4,其中：【主权项】1. ，其特征在于，所述方法 包括： 获得不同水稻品种间的变异位点； 通过所述变异位点确定待测水稻品种的测试区域，所述测试区域包括通用测试区域， 至少部分所述变异位点包含在所述通用测试区域内； 构建包含所述待测水稻品种在所有所述测试区域的基因型的数据库； 确定所述待测水稻品种的抽样量SN后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA ; 制备扩增所述测试区域的引物，所述引物包括所述通用测试区域引物； 利用所述引物对所述混合样本的DNA进行扩增，得到所述测试区域的扩增产物，所述 扩增产物用于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性与稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括：获得不同水稻品种间的变异位点；通过所述变异位点确定待测水稻品种的测试区域，所述测试区域包括通用测试区域，至少部分所述变异位点包含在所述通用测试区域内；构建包含所述待测水稻品种在所有所述测试区域的基因型的数据库；确定所述待测水稻品种的抽样量SN后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA；制备扩增所述测试区域的引物，所述引物包括所述通用测试区域引物；利用所述引物对所述混合样本的DNA进行扩增，得到所述测试区域的扩增产物，所述扩增产物用于构建高通量测序文库；对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，获得待测水稻品种基因型和杂株基因型；将所述待测水稻品种基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得所述待测水稻品种的近似品种、变异位点和变异位点率；将所述杂株基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得杂株品种后，计算杂株率；利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测水稻品种特异性、一致性和稳定性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭海，张静，陈红，方治伟，冯涛，
申请(专利权)人：江汉大学，农业部科技发展中心，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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