低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法技术

低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法，将80%密度梯度培养基0.5ml加入锥形管中，然后将40%密度梯度培养基0.5ml加在液面之上，使之液面分层清晰；充分混合附睾液标本，将0.5ml附睾液缓慢的加在40%密度梯度培养基液面上，使之液面分层清晰；离心400×g15min，优质精子将在锥形管底部沉淀；轻轻吸取出沉淀，悬浮于5mlHET培养基中，离心300×g8min以去除残留的密度梯度培养基；吸出沉淀，悬浮于3.0ml精子获能培养基中，离心300×g5min以去除残留的HTF培养基；去除上清液，留取0.5ml左右的获能液与沉淀充分混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中代用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从人附睾液中回收高质量精子的方法，具体涉及低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法。
技术介绍
卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术是目前治疗梗阻性无精症的唯一有效方法[1]，此技术使得无数梗阻性无精症患者拥有了自己的后代。通过人类经皮附睾精子抽吸术（PESA）获得的精子是ICSI精子的主要来源之一，但是经PESA取得的精子密度、活率和前向运动率很差，传统的高低密度梯度力心法只适合洗涤体外射出的、密度和活率较高的精液，如果用此方法洗涤PESA精子则不能有效回收高质量精子（传统梯度离心密度培养基加入量为2.5-3.0 ml），目前普遍使用的洗涤PESA精子方法是直接用HET洗涤培养基离心附睾液，此方法不能有效去除附睾液中的红细胞、白细胞和鞘膜积液等杂质，在进行ICSI操作时这些杂质经常阻塞和粘连穿刺针，甚至在操作过程中需要更换穿刺针，增加了操作成本和操作时间，使得卵子在培养箱外暴露时间延长，卵子超微结构损伤的概率增加,影响的卵子的受精率和胚胎的种植潜能[2].(参考文献：[1]董瑞娜,郭艺红,孙莹璞等，3106个不同来源精子ICSI周期临床妊娠结局分析.生殖与避孕，2013,4（33）：233-238 [2]靳镭, 朱桂金, 章汉望, 等. PESA 结合ICSI治疗无精子症其后代安全性的回顾性研究. 中华现代临床医学杂志, 2006,4( 11) : 1025-1027）。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足，从而提供一种低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法。原理为：低剂量密度梯度离心法所加入梯度培养基量少，为传统方法的30%-40%，液面较低，活动精子在离心时比无活力的精子更主动地沿沉淀梯度的方向运动、从而穿过不同密度界面的特点，可以回收较多的活动的精子，回收率比目前普遍应用的HET洗涤培养基离心法好，本专利技术采用低剂量高低密度梯度离心法减少了密度梯度培养基的用量，使得在有效去除附睾液中杂质的同时最大限度的收集附睾液中的活动精子。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤和条件：步骤一：将80%密度梯度培养基0.5ml加入锥形管中，然后小心的将40%密度梯度培养基0.5ml加在页面之上，使之液面分层清晰；步骤二：充分混合附睾液标本，将0.5ml附睾液缓慢的加在40%密度梯度培养基，使之液面分层清晰；步骤三：离心400×g15min，优质精子将在锥形管底部沉淀；步骤四：轻轻吸取出沉淀，悬浮于5mlHET培养基中，离心300×g8min以去除残留的密度梯度培养基；步骤五：吸出沉淀，悬浮于3.0ml精子获能培养基中，离心300×g5min以去除残留的HTF培养基；步骤六：缓慢的去除上清液，留取0.5ml左右的获能液与沉淀充分混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中代用。采用上述技术方案的有益效果是：本专利技术提供的低剂量高低密度梯度离心法，是一种操作简单、实用的精液处理方法，适用于洗涤人类经皮附睾精子抽吸术（PESA，又称作附睾穿刺术）提取的精子，能有效的去除附睾液中的红细胞、白细胞、鞘膜积液和细菌等杂质，有利于精子体外获能，有效避免了在单精子卵胞浆内注射（ICSI）操作中杂质堵塞和粘连穿刺针情况的发生，减少卵子体外操作时间，最大限度的减少温度、湿度和CO2浓度的变化对卵子纺锤体、微丝等超微结构的损伤，从而可以改善卵子受精潜能和胚胎发育潜能，以提高卵子受精率和胚胎种植率。具体实施方式低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法，具体实施方式再述于下，它由下述步骤组成：步骤一：高低密度梯度离心培养基：由美国Coopersurgical公司生产，货号：ART-2024。将80%密度梯度培养基0.5ml加入锥形管中，然后小心的将40%密度梯度培养基0.5ml加在页面之上，使之液面分层清晰；步骤二：充分混合附睾液标本，将0.5ml附睾液缓慢的加在40%密度梯度培养基，使之液面分层清晰，如附睾液体积较大，可同时使用多个锥形管；步骤三：离心400×g15min，优质精子将在锥形管底部沉淀；步骤四：HTF精子洗涤培养基由美国Coopersurgical公司生产，货号：ART-1006。轻轻吸取    出沉淀，悬浮于5mlHET培养基中，离心300×g8min以去除残留的密度梯度培养基；步骤五：精子获能洗涤培养基由美国Coopersurgical公司生产，货号：ART-1020。吸出沉淀，悬浮于3.0ml精子获能培养基中，离心300×g5min以去除残留的HTF培养基；步骤六：缓慢的去除上清液，留取0.5ml左右的获能液与沉淀充分混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中代用。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法，其特征在于：它由下述步骤组成：步骤一：将80%密度梯度培养基0.5ml加入锥形管中，然后小心的将40%密度梯度培养基0.5ml加在页面之上，使之液面分层清晰；步骤二：充分混合附睾液标本，将0.5ml附睾液缓慢的加在40%密度梯度培养基，使之液面分层清晰；步骤三：离心400×g15min，优质精子将在锥形管底部沉淀；步骤四：轻轻吸取出沉淀，悬浮于5mlHET培养基中，离心300×g8min以去除残留的密度梯度培养基；步骤五：吸出沉淀，悬浮于3.0ml精子获能培养基中，离心300×g5min以去除残留的HTF培养基；步骤六：缓慢的去除上清液，留取0.5ml左右的获能液与沉淀充分混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中代用。

【技术特征摘要】
1.低剂量高低密度梯度离心法洗涤人类PESA精子的方法，其特征在于：它由下述步骤组成：
步骤一：将80%密度梯度培养基0.5ml加入锥形管中，然后小心的将40%密度梯度培养基0.5ml加在页面之上，使之液面分层清晰；
步骤二：充分混合附睾液标本，将0.5ml附睾液缓慢的加在40%密度梯度培养基，使之液面分层清晰；
步骤三：离心400×g15min...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛斌，杨智敏，刁英，杨名慧，宫黎明，姚观平，董世桃，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52