贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法，属于酵母育种新菌株的鉴定方法。本发明专利技术包括：贝酵母杂交；贝酵母菌株耐硫性测定；提取和纯化贝酵母DNA：以FZF1为引物的PCR反应体系及程序；PCR产物测序及鉴定等；此后进一步对耐硫杂交后代ISSR分析。实施例从3个杂交组合获得18个疑似杂交后代。PCR分析是18个疑似杂交后代中有5个菌株只含非耐硫亲本的特征条带，2个含耐硫亲本的特征条带，其余11个则含有双亲的特征带。对8个耐硫杂交后代ISSR分析表明：有两个单菌落的指纹图谱完全一致为同一菌株。本发明专利技术以DNA序列及ISSR图谱为依据加上耐硫表型筛选获得6种耐硫贝酵母杂交后代菌株，显著提高了杂交后代菌株鉴定的准确率。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法，包括以下步骤：????（1）贝酵母杂交：参照Codon等（1995）的方法进行；????（2）贝酵母菌株耐硫性测定：将不同菌株接种于新鲜的含15?mg/L?亚硫酸钠的YPD(pH?3.5，含琥珀酸盐)上，能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株；????（3）提取和纯化贝酵母DNA：将菌种采用划线法接种到新的培养基上，获得单菌落；接种单菌落酵母到10mL酵母试管培养基中(YPD培养基)，28℃，培养18h；取1.5mL酵母培养液,12000r/min离心1min收集菌体,加入600μL山梨醇buffer,5μL10U/μL溶菌酶(Lyticase),30℃处理30min；4000r/min离心10min,沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬,加入20μL蛋白酶K混匀,加入4μL?RNaseA(100mg/mL),室温放置5min；加入220μL缓冲液GB,颠倒混匀,70℃放置10min,加220μL?无水乙醇充分颠倒混匀,所得溶液和沉淀都加入吸附柱中,12000r/min离心30s,向吸附管中加入500μL缓冲液GD,12000r/min离心30s,向吸附柱中加入500μL漂洗液PW洗两次,最后加入30μLddH2O洗脱柱子上的酵母基因组DNA；（4）组成PCR反应体系（单位：微升）配方：?????????????????????2.5?微升?10×PCR?buffer?(包含?Mg2+),?????????????????????1?微升的?10?mM?前导链引物?????????????????????1?微升的?10?mM?后导链引物??????????????????????0.5?微升的10?mM?of?each?dNTP?????????????????????0.2?微升的5U/μL?Taq?DNA?聚合酶?????????????????????2?微升?模板DNA?????????????????????17.8微升??dH2O??????上述PCR反应体系以FZF1为基因扩增引物：L1:?TAC?GGG?TTG?ACC?ACT?CCA?AT；R1:?CAC?CGC?GTT?CAT?ATC?ATC?AG；（5）PCR反应程序：①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③60℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②?④35个循环；⑥72℃延伸7分钟；（6）PCR产物用凝胶成像系统观察结果：经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5?μg·mL?1的溴化乙锭，电压为3～5?V/cm，照像记录；???（7）PCR产物测序：获得的序列用Vector?NTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对，鉴定结果：耐硫亲本只产生一条大小为1020bp的条带；而非耐硫亲本为一条700bp的条带。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小珍，张汉尧，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：
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