一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法及其应用，选取MyoD1基因作为影响阿勒泰羊产肉量的候选基因，利用PCR-SSCP技术检测阿勒泰羊品种中MyoD1基因的遗传结构，分析和判断其与绵羊产肉量的相关关系，通过绵羊MyoD1基因的DNA序列，自行设计两对特异性引物，利用PCR-SSCP技术对新疆阿勒泰羊MyoD1基因进行多态性检测，并与产肉性状进行相关性分析，从而找出与阿勒泰羊产肉量显著相关的分子标记，本发明专利技术用以提高阿勒泰羊的产肉性能，从而大大加快提高恢复阿勒泰羊优良产肉性能的速度，这对于提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业的发展具有重要意义和实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法及其应用，选取MyoD1基因作为影响阿勒泰羊产肉量的候选基因，利用PCR-SSCP技术检测阿勒泰羊品种中MyoD1基因的遗传结构，分析和判断其与绵羊产肉量的相关关系，通过绵羊MyoD1基因的DNA序列，自行设计两对特异性引物，利用PCR-SSCP技术对新疆阿勒泰羊MyoD1基因进行多态性检测，并与产肉性状进行相关性分析，从而找出与阿勒泰羊产肉量显著相关的分子标记，本专利技术用以提高阿勒泰羊的产肉性能，从而大大加快提高恢复阿勒泰羊优良产肉性能的速度，这对于提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业的发展具有重要意义和实际应用价值。【专利说明】一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法及其应用专利
本专利技术涉及动物分子遗传育种
，具体的涉及利用分子生物技术寻找影响新疆阿勒泰羊产肉量性状的有效分子标记，进而应用于提高阿勒泰羊产肉性能的
。
技术介绍
新疆是我国主要牧区之一，具有丰富的绵羊品种资源，其中阿勒泰羊以体格大、肉脂生产性能高而著称，具有耐粗饲、善跋涉、抗严寒、体质坚实、适宜放牧等特点，是新疆地方优良肉羊品种。但新疆阿勒泰地区少数民族占绝大部分，冬季长达近半年，且最冷可达-35--40°C，由于自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存。而阿勒泰羊就是在这样一个特殊的条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的，即适应于当地条件，又有较高产肉性能的绵羊品种，其活重最高可达171千克，屠宰率达49-50%。此外，阿勒泰羊肉质鲜美，且由于其放牧草场天然无污染，可通过阿勒泰羊生产有机羊肉，打入高端市场，以此来增加当地农牧民的经济水平，进而提高和改善生活水平。可见，阿勒泰羊是当地农牧民主要的食用肉羊和养殖家畜，既是生活资料又是生产资料。由于新疆地区少数民族的传统习惯和宗教信仰，对于羊肉的需求量极大，近年来羊肉价格居高不下。因此，具有优良产肉性能且深受当地农牧民喜爱的阿勒泰羊，对于解决新疆羊肉供不应求、少数民族生活安定小康具有重要意义。阿勒泰羊作为地方优良品种，具有其独特性，应做好品种资源的有效保护，但由于近年来长期未经选育提高，其优良产肉特性没有得到合理的开发利用，极大地不利于当地经济和新疆肉羊产业的发展。目前，运用先进技术`手段，结合现代育种技术和传统育种方法，发展新疆优势特色畜牧业，提高绵羊良种化程度，培育肉羊专门化品种，提高羊肉生产水平，是加快新疆绵羊产业发展的有效手段。绵羊的产肉量属于经济性状。现代育种技术中，利用候选基因策略，可大幅度提高重要经济性状选育的效率。所谓候选基因策略就是从生理、生化角度考虑，把一些功能基因作为影响相应生产性状差异的候选基因，再在候选基因中寻找与性状表型变异相关的DNA信息作为标记，间接作为早期选种的依据，用于品种改良或新品种选育的方法。我国四川省皮肉兼用型山羊新品种南江黄羊就是采用分子育种方法，仅用了 8年时间就育成的品种。肌肉的生长需要成肌细胞的增殖和分化，因此动物的产肉力与肌纤维细胞的数量和生长密切相关。有研究表明，生肌决定因子(Myogenic Determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调节控制作用的一个重要基因家族，可启动和维持骨骼肌细胞分化发育和生长、激活静止状态的肌肉特有基因与肌肉特有的增强子结合共同促进转录、促使某些细胞向骨骼肌细胞分化，与肌细胞的生成、动物的产肉量密切相关。现有技术记载了生肌决定因子(MyoD)包括 4 个基因:MyoDl (MyoD 或 myf3)、Myogenin (MyoG 或 Myf4)、Myf5> Myf-6(herculin 或 MRF4)。目前，在国内外未见到利用候选基因策略对阿勒泰羊产肉性状进行选育提高的研究和报道，完全属于空白。此外，对于将MyoDl基因作为影响家畜生产性能候选基因，开展相关研究的报道多见于山羊、牛及猪中，在绵羊中未见报道，在阿勒泰羊类中应用研究完全未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中未见报道专门针对阿勒泰羊产肉量显著相关的分子标记研究的技术现状。本专利技术旨在为了提供了一种利用分子标记技术寻找影响新疆阿勒泰羊产肉量有效分子标记的方法，用于选育提高阿勒泰羊产肉性能。本专利技术的技术方案:采用候选基因策略，选取MyoDl基因作为影响阿勒泰羊产肉量的候选基因，利用分子标记技术PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism,单链构象多态性)检测阿勒泰羊品种中MyoDl基因的遗传结构，从分子水平上，科学分析和判断其与绵羊产肉量的相关关系，通过绵羊MyoDl基因的DNA序列(GenBank登录号:ΝΜ_001009390)，借助公知软件Primer5.0自行设计两对特异性引物，利用PCR-SSCP技术对新疆阿勒泰羊MyoDl基因进行多态性检测，并与产肉性状进行相关性分析，从而找出与阿勒泰羊产肉量显著相关的分子标记，用以提高阿勒泰羊的产肉性能，从而大大加快提高恢复阿勒泰羊优良产肉性能的速度，这对于提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业的发展具有重要意义和实际应用价值。本专利技术提供了一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法，具体方法步骤如下: (I)找出阿勒泰羊品种中MyoDl基因的突变碱基:根据绵羊MyoDl基因的DNA序列，自行设计两对特异性引物，应用PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism,单链构象多态性)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide GelElectrophoresis, PAGE)技术,检测阿勒泰羊品种中MyoDl基因特异性扩增片段的遗传结构和多态性，筛选出具有多态性的基因片段，即该基因片段存在多种基因型，并经过DNA测序，找出导致基因扩增片段出现多种基因型的突变碱基。(2)进行突变碱基与阿勒泰羊产肉量的关联分析，确定影响阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记并进行显著性检验，研究阿勒泰羊中多态基因不同基因型间产肉量的差异，由此判断该基因能否作为影响阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记；经显著性检验，P < 0.01时差异极显著；P < 0.05时差异显著；P > 0.05时差异不显著；若差异显著或极显著，则说明导致基因扩增片段出现多种基因型的突变碱基是显著影响阿勒泰羊产肉量的基因突变位点，该多态基因可作为影响阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记。具体的，本专利技术进一步详细提供了一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法，其具体方法步骤如下:(I)阿勒泰羊基因组DNA提取:采集阿勒泰羊血样5ml，提取DNA，在-20°C保存；0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断DNA的提取质量。(2)阿勒泰羊MyoDl基因特异性引物设计:利用绵羊MyoDl基因的DNA序列(GenBank登录号:ΝΜ_001009390)，自行人工设计两对特异性引物，两对特异性引物序列分别为:引物1:上游引物F:5' -CCGCTGTTTACTGTGGG-3'下游引物R:5' -GCTGGTTTGGGTTGCT-3'引物2:上游引物F: 5' -AGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法，其特征在于，具体方法步骤如下：(1)阿勒泰羊基因组DNA提取：采集阿勒泰羊血样5ml，提取DNA，在?20℃保存；0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断DNA的提取质量；(2)阿勒泰羊MyoD1基因特异性引物设计：利用绵羊MyoD1基因的DNA序列(GenBank登录号：NM_001009390)，自行人工设计两对特异性引物，两对特异性引物序列分别为：引物1：上游引物F：5′?CCGCTGTTTACTGTGGG?3′；下游引物R：5′?GCTGGTTTGGGTTGCT?3′；引物2：上游引物F：5′?AGCAACCCAAACCAGC?3′下游引物R：5′?ATGCCGTCGGAACAGT?3′；(3)阿勒泰羊MyoD1基因的PCR扩增：根据设计的两对引物，特异性扩增阿勒泰羊MyoD1基因的两个片段；PCR反应体系为：Mi?x10.0μl，上下游引物各0.4μl，DNA模板1.5μl，加水至总体积20μl；反应条件为：94℃预变性5mi?n，94℃变性30s、退火温度30s、72℃延伸1mi?n，循环31次，72℃延伸5mi?n，4℃保存；特异性扩增的两个PCR产物均由1％琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量；(4)SSCP检测：分别对阿勒泰羊MyoD1基因的两个PCR产物进行SSCP检测，筛选具有多态性的PCR扩增片段；取3μl?PCR产物与7μl的98％去离子甲 酰胺的变性剂混合，98℃变性10min后冰浴10min，使之保持变性状态；变性后PCR产物用8％非变性聚丙烯凝胶(polyacrylamide?gel，PAG)180V电泳20h，银染显色后，于凝胶成像仪白光下照射，观察条带的大小，判断有无多态性，有多态的判断基因型；(5)DNA测序，找出阿勒泰羊MyoD1基因突变位点；对于SSCP检测中具有多态性的基因，将其不同基因型的PCR产物进行DNA测序，用以判断突变碱基和位点；(6)突变碱基与阿勒泰羊产肉量进行关联分析，确定影响阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记，并对阿勒泰羊中多态基因不同基因型间的个体体重进行显著性检验；经显著性检验，P＜0.01时差异极显著；P＜0.05时差异显著；P＞0.05时差异不显著；若差异显著或极显著，则说明导致基因扩增片段出现多种基因型的突变碱基是显著影响阿勒泰羊产肉量的基因突变位点，该多态基因可作为影响决定阿勒泰羊产肉量的DNA分子标记。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘武军，王琼，邵勇钢，刘玲玲，马海玉，于茜，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：