一种一次离心法制备富血小板血浆的方法技术

本发明专利技术属于富血小板血浆制备技术领域，具体公开了一种以一次离心法制备富血小板血浆（PRP）的方法。所述方法仅利用一部高速自动离心机，采用一次离心法，整个过程仅需一次移液（吸取分界层血浆），以达到方便快捷、污染风险低的目的。而且，利用本发明专利技术所述方法制备得到的富血小板血浆中血小板细胞浓度均值达1029.875×109/L；PRP中血红蛋白量为20.26g/L，可以很好的满足临床需要。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于富血小板血浆制备
，具体公开了一种以一次离心法制备富血小板血浆（PRP）的方法。所述方法仅利用一部高速自动离心机，采用一次离心法，整个过程仅需一次移液（吸取分界层血浆），以达到方便快捷、污染风险低的目的。而且，利用本专利技术所述方法制备得到的富血小板血浆中血小板细胞浓度均值达1029.875×109/L；PRP中血红蛋白量为20.26g/L，可以很好的满足临床需要。【专利说明】
本专利技术涉及富血小板血浆的制备方法，具体地，涉及。
技术介绍
富血小板血衆(platelet-rich plasma, PRP)是通过离心人或动物自身的全血而得到的含高体积分数血小板的血浆。自从上世纪80年代DAVID R.KNIGHTON等人发现血小板细胞能促进血管增生、胶原合成后，人们便致力于将富血小板血浆(PRP)应用于临床，渴望解决修复能力低下的器官组织的损伤修复问题。但由于当时PRP制备困难，限制了其在临床上的推广。经过几十年的研究，已探索出几种较为合适的富血小板血浆制备方法:手工法(一次离心法、二次离心法和三次离心法)及设备制备法。其中，二次离心法的PRP的提取率最高，在临床的应用也最广。利用二次离心法制备PRP的原理如下:(I)抽取静脉血液并将其注入含抗凝剂的试管内；(2)第I次离心可将血液分为3层，最底端的部分为约占血液总体积分数55%的红细胞；顶端部分为约占总体积分数40%的贫血小板血浆(platelet-poorplasma, PPP)，主要是纤维蛋白原等血浆成分；中间层为仅占总体积分数5%的血小板浓缩物(platelet concentrate, PC)，即俗称的黄衣层；(3)用移液器吸取PPP和PC以及紧邻PC的部分红细胞，并将其注入另一不含抗凝剂的试管中；(2)以一定的速度和时间再次将其离心并将血浆分为3层，最底端是少量剩余的红细胞，顶端是约占总体积分数80%的PPP，两层之间即富集的血小板；(5)用移液器抽取大部分的PPP，并留取足够的血清来容纳悬浮于其中的富集的血小板，得到PRP。另外，PRP中的血小板在体外较脆弱且容易激活，过高的离心速度会使血小板膜破裂降低其生物活性，而较低的离心速度可使血小板活性在制备过程中保持在最低水平，因此离心时速度不宜过快。而且，在不同的离心次数、离心力和离心时间所制备出的PRP中，血小板的体积分数以及各种生长因子的量和活性各不相同。目前虽能制备出成分较为单一、浓度达标的PRP，但其制备技术仍未完全成熟，大多数人推崇的二次离心法存在着操作复杂、过程漫长、产品污染的风险。我国威高公司即将上市的PRP设备存在着PRP中血小板浓度不高的缺陷，而在美国已经上市的PRP设备，其PRP中血红蛋白浓度未公开，因此可能存在着血小板细胞浓度高但纯度不高的缺陷，而且各个上市的PRP设备，其价格相当昂贵，在临床应用推广方面受到较大限制，尤其在发展中国家的应用。目前，解决PRP制备问题的方法仍值得进一步探究，以得到一种方便快捷、纯度及浓度高、价格低廉的制备方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题克服目前传统手工法制备富血小板血浆浓度或纯度不高、以及手工二次离心法制备过程复杂、采用上市设备套装制备成本高的缺陷，为临床研究提供一种能制备得到浓度及纯度均高的富血小板血浆的技术，其制备过程简便，成本低。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现: ，包括如下步骤:将混有抗凝剂的全血以1400g的离心力离心15分钟，离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，然后均匀吸取中层血浆即得富血小板血浆。优选地，所述抗凝剂为肝素或水蛭素。更优选地，所述抗凝剂为肝素。优选地，所述肝素在全血中的添加量按照肝素与全血的体积比为0.2:10来确定，所述肝素为12500单位/2mL的肝素。优选地，所述富血小板血浆的具体制备方法为:将混有1.0mL浓度为12500单位/2mL肝素的50mL全血以1400g离心力进行离心15min分钟；离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，于中层均匀吸取4mL血浆即得富血小板血浆。本专利技术仅利用一部高速自动离心机，采用一次离心法，整个过程仅需一次移液(吸取分界层血浆)，以达到成本低、制备方便快捷、污染风险低的目的。经过广东省人民医院骨科的研究(结果见附表及图)，本专利技术专利制备得到的PRP中其平均血小板浓度达1029.875X 109/L(为全血血小板浓度的3.8倍，标准差为259.92，标准误为91.89，95%可信区间为(812.58,1247.17))，平均血红蛋白浓度仅为20.26g/L (标准差为15.82，标准误为5.59，95%可信区间为(7.03，33.49 ))，这就达到纯度及浓度高的目的。本专利技术专利制备的PRP，仅利用一台高速离心机即可，制备消耗理所当然较采用上市的设备套装制备成本少，因此具有价格低廉的优点。本专利技术所述方法比传统的一次离心法(Anitua法)好:在1999年,西班牙EduardoAnitua博士专利技术了 Anitua法。他当时采集患者10至20mL静脉血,加入5mL的多个离心管内，以160g离心力离心6分钟，然后弃取上层(贫血小板血浆层)1ml，再吸取剩余上层血衆至下层(红细胞层)1?2mm,这样5mL的静脉血大约可以获取1.2mL的PRP。他当时分析(n=10)，所弃去的上层血浆中血小板细胞数量仅仅少于全部血小板的15%，可见仍有较多血小板残存于上层而被弃掉，表明Anitua法所采取的的离心时间和离心力不足以使大部分血小板沉降于中层。本专利技术技术的离心时间及离心力均较Anitua法多，可使滞留于上层的血小板沉降至中层。与二次离心法(Landesberg法)相比:二次离心法制备的PRP时，初次离心采用低速离心，然后取交界面下3mm以上的血浆，这其中必然残存有大量的血红蛋白。而在第二次高速离心后，吸取全部下层血浆，即为PRP，这其中包含了初次离心后残留的血红蛋白。以Landesberg法制备得到的PRP中，血红蛋白量高。另外，二次离心法需多经一次移液，制备过程复杂，污染风险高。与现有富血小板血浆制备方法、制备设备相比，本专利技术具有以下有益效果: (I)本专利技术所述富血小板血浆的制备方法与传统一次离心法相比，制备得到的PRP的浓度及纯度更高，与二次离心法相比则更加方便、快捷，大大降低手工法制备富血小板血浆的操作时间及污染风险。本专利技术专利的技术方法耗时15分钟，而二次离心法中最为推崇的Landesberg法耗时较多，需两次均为10分钟离心时间，加上额外I次的吸取移液的操作时间，而且，二次吸取移液过程不仅增加了操作的复杂性，更严重的是增大了污染机会。本专利技术专利的技术方法仅需I次离心，则避免了第二次吸取移液的过程，操作更为简便，更重要的是大大降低血浆直接暴露的时长。(2)本专利技术专利的技术方法制备的富血小板血浆中血小板细胞浓度均值达1029.875X 109/L。而在本研究单位利用Landesberg法制备得到的PRP中血小板细胞浓度为1204.8333X 109，两者比较没有明显差异；但在另一方面，利用本专利技术专利的技术方法制备得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一次离心法制备富血小板血浆的方法，其特征在于，将混有抗凝剂的全血以1400g的离心力离心15分钟，离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，然后均匀吸取中层血浆即得富血小板血浆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑秋坚，林子洪，沈梓维，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：