进行数字测量的方法和系统技术方案

本发明专利技术提供了进行数字化测量的方法、装置和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】进行数字测量的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求于2011年1月20日提交的第61/434,670号美国临时专利申请的权利，出于所有目的将其全文清楚地引入本文作为参考。专利技术背景本专利技术涉及进行数字测量的方法、装置和系统。更具体地，本专利技术涉及在不同体积中进行数字测量的方法、装置和系统。数字测量因其所提供的稳定性、较高的灵敏度和较高的准确性而在生物学中日益重要。此外，与模拟测量不同，在所述模拟测量中通常必须通过加标（runningstandard）进行校准，数字测量是基于计算二进制是或否的回复，不需要校准，从而节省用户的时间，增强稳定性和分析的方便性。数字分析的一个重要应用是对样品中存在的DNA或RNA的准确定量。在这里，检测DNA或RNA的最广泛使用的方法是聚合酶链反应（PCR），其中样品通常在约60℃和95℃的两个或三个温度之间循环。使用PCR扩增DNA或RNA大大地推进了大范围的学科，范围从基础生物学到临床诊断学和法医学。诊断学和生物医学研究中常用的一种特别形式的PCR是定量PCR（qPCR），它不仅能够检测样品中是否存在DNA或RNA，而且能准确地测量其浓度。这是进行后续决策和分析的一个重要的数据点-——例如，通过在试验样品中检测到的病毒RNA载量确定给患者的HIV治疗药物的量。目前，进行qPCR的最常见形式是实时PCR，广泛应用于多个领域，包括基础生物医学研究和临床诊断学。在实时PCR中，样品的绝对浓度是通过扩增过程的时间进展推导出来的，其中所述扩增过程通过能够具体地识别扩增产物的荧光探针监测，如分子信标或探针。实时PCR对各种错误敏感，包括不需要的引物二聚体的形成，其中引物分子由于其序列中的互补段而彼此附着。这样就会产生一种副产物，可以与现有PCR试剂的靶元素相竞争，从而能够抑制靶序列的扩增，并且干扰准确的定量。目标的定量还要求对每个循环的扩增效率有精确的了解，并且由于增长是指数性的，扩增效率中微小的不确定性（例如，低于阈值检测水平）会使目标拷贝数的确定发生极大的错误。当核酸的初始浓度低或荧光检测不够灵敏时，这种错误会非常大。虽然实时PCR能够识别并定量复杂样品中的靶DNA，但还是不能足够精确地定量低样品浓度，而这正是例如病原体检测或临床诊断学所需要的。为了解决实时PCR难以定量低拷贝数DNA的问题，发展了数字或限制稀释DNA扩增，所述数字或限制稀释DNA扩增能够更准确地定量样品中模板拷贝的绝对数。在dPCR中，总样品被分为一批小的体积，使得根据Poisson统计，只有少数的体积含有一个或多个靶分子，而大多数体积不含DNA。然后，在所有体积中同时进行DNA扩增，使只有含有靶分子的那些少数体积中的荧光增加。通过对荧光体积（即含有DNA拷贝的那些）进行计数，就能简便而准确地确定DNA拷贝数。dPCR的概念很有吸引力，但其尚未广泛应用，这是因为（1）不易建立dPCR中使用的一大批的极小的体积（皮升到纳升），以及（2）实验的动态范围由离散阵列的大小和数量限定，通常极低。为了准确地定量样品中DNA或蛋白的量，大多数区室通常最多含有一个靶分子。这就意味着样品的初始浓度与分析的动态范围相匹配。换句话说，初始样品浓度应当在向运行dPCR的设备中输入正确的样品浓度之前进行测定。这会增加运行dPCR的不便，并会限制具有恒定体积的数字阵列的可能性。不管使用何种具体的反应，重要的是克服数字分析的有限动态范围。直接的方法是通过增加相同大小的数字体积的数量来扩大分析的范围。这一方法是有问题的；为了容纳大量的体积，设备需要很大，并会涉及相当复杂和昂贵的微加工过程。因此，需要进行数字测量的另外的方法和系统。除了上述dPCR的实际问题之外，精确的温度控制和温度循环也阻碍着该方法的广泛使用。一般来说，退火和解链步骤的温度控制在+/-1摄氏度。对于DNA和RNA绝对定量重要的许多应用，这些因素难以满足，或者其实现昂贵，特别是在资源有限的环境以及医疗点中。为了提供在这些环境中扩增DNA和RNA的更为符合人体工学的方式，开发了几种等温方法，包括滚环扩增（RCA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）或环介导扩增（LAMP）。LAMP是用于扩增DNA或RNA的等温过程，在60-65摄氏度的固定温度下有极高的特异性。由于其高的特异性，LAMP在扩增过程中能够区分单核苷酸差异。因此，LAMP已应用于SNP（单核苷酸多态性）分型。LAMP还显示能够检测病毒RNA，其灵敏度比RT-PCR高约十倍。LAMP与其它等温方法区分的另一个特征是其能够直接将DNA的扩增与增加溶液浑浊度的焦磷酸镁的产生相关联。这样，使用一个浊度计就可以跟踪LAMP溶液的进展。因此，非均质分析可以用来检测LAMP产生的扩增产物。焦磷酸镁的产生也能够以荧光指示剂的形式使用，这对数字分析的读出特别有用。在反应前，在反应混合物中加入少量的钙黄绿素。在扩增过程中，焦磷酸盐的产生增加会使含有一个或多个靶分子的体积中的钙黄绿素荧光快速增加。这些反应在固定温度下进行，可以减少仪器的复杂度，降低能耗，使其更适合于治疗点诊断和家庭医疗设备。将这些方法转换为数字形式是为了更好、更准确地在治疗点检测出病原体的重要步骤。另外，数字分析还会提高基于蛋白扩增的分析的准确度，如ELISA（酶联免疫吸附试验）或任何单分子分析，其中所述单分子分析可能要求或不要求扩增。鉴于上述情况，需要提供进行数字测量的改进的方法和系统。此外，还需要提供使用数字测量的另外的技术，例如数字LAMP。本文公开的本专利技术提供这些需要以及更多。专利技术概述本专利技术提供进行数字化测量的方法、装置和系统。更具体地，本专利技术涉及在不同体积中进行数字测量的方法、装置和系统。在一些方面中，本专利技术提供增加数字测量动态范围的方法和装置，包括但不限于数字PCR、数字等温核酸扩增（例如：数字NASBA和数字LAMP）、数字蛋白扩增（例如：数字ELISA）、数字单分子测量以及其它形式的数字测量。在一个方面中，本专利技术提供一种用于扩大样品数字测量的动态范围的方法，所述方法包括：建立样品浓度梯度；和／或建立不同大小的样品体积。在一个实施方案中，动态范围是通过将数字测量和读数与用于形成浓度梯度的方法和装置整合而扩大的。分析物分子的浓度梯度优选地呈对数或指数形状，但也可以是许多其它形状，包括但不限于线性、多项式、误差、高斯、指数、对数、及其任何组合。在另一个实施方案中，通过使用不同大小的数字化体积扩大动态范围。例如，动态范围可以通过在同一芯片或基底上具有下列数字化体积阵列实现：体积为100nL的第一组阵列、体积为10nL的第二组阵列、体积为1nL的第三组阵列、体积为100pL的第四组阵列、体积为10pL的第五组阵列、体积为1pL的第六组阵列、体积为100fL的第七组阵列、体积为10fL第八组阵列、最后是体积为1fL的第九组阵列。根据最终的应用，可能在同一芯片上不需要有所有这些阵列组。对于一些应用，从1fL到1nL的阵列可能就足够了；而对于其它应用，从100nL到1pL的阵列可能更合适。然而对于其它应用，仅有不同体积的两组阵列可能就足够了。含有不同体积的阵列组的数量会不同，并取决于每个阵列的大小。例如，如果一个阵列包含一百万个数字化体积，则可能无需涵盖pL到n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.01.20 US 61/434,6701.一种采用数字化测量确定样品中分析物的浓度的方法，所述方法包括：生成具有体积分布的多个液滴，其中所述体积分布为连续的体积分布并且其中所述多个液滴中的至少一个液滴包含来自于所述样品的成分；对多个液滴中的一些或全部进行分析，以确定多个液滴中的一些或全部中的单个液滴的体积以及多个液滴中的一些或全部中包含可检测试剂的液滴的数量；以及使用多个液滴中的一些或全部中的单个液滴体积和多个液滴中的一些或全部中包含可检测试剂的液滴的数量确定所述样品的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过合并不互溶流体而在乳液中产生所述多个液滴。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述不互溶流体包括水和油。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述乳液包括表面活性剂。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个液滴的体积分布包括以下体积范围：100纳升(nL)到1毫微微升(fL)、10nL到10fL、1nL到100fL、100nL到1皮升(pL)、10nL到10pL、1nL到1pL。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂是荧光的。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述可检测试剂与核酸分子、肽、蛋白或其组合关联。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括进行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导的扩增(LAMP)或其组合。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂的浓度在至少三个数量级的动态范围内确定。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂的浓度在至少六个数量级的动态范围内确定。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述体积分布中的体积变化超过两倍。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述体积分布中的体积变化超过10倍或超过100倍。13.一种采用数字化测量确定样品中分析物的浓度的系统，所述系统包括：包含具有体积分布的多个液滴的样品容器，其中所述体积分布为连续的体积分布；用于检测在多个液滴中的至少一个液滴内含有的可检测试剂的检测器；以...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·T·赵，B·S·藤本，A·R·甘森，G·S·言，R·M·洛伦兹，
申请(专利权)人：华盛顿大学商业中心，
类型：
国别省市：