用于分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法技术

本发明专利技术涉及一种分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法。所述方法包括下述步骤：a)从所述血样的无核血细胞中提取核酸以提供无核血细胞提取的核酸片段，以及b)分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在，其中，所述疾病标记物是所述受试者细胞的基因中的疾病特异突变，或其中所述疾病标记物是所述受试者的细胞的基因的疾病特异表达谱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于医疗诊断领域，具体地属于疾病诊断和监测领域。本专利技术涉及一种用于检测疾病的标记物，涉及一种用于检测疾病的方法，以及涉及一种用于确定疾病治疗疗效的方法。
技术介绍
在临床实践中，强烈需求能够在疾病早期阶段检测疾病以预测疾病的进展，并进行为病人定制的治疗。特别是肿瘤性疾病(癌症)的早期发现是至关重要的，以确保疾病的有利治疗。尽管医学研究中的许多进展，癌症仍然是全球死亡的一个重要原因。当患者求医时，他们一般都表现出远处转移症状，意为往往发现癌症为时已晚。肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌是最常见的肿瘤，并为了通过手术切除、放疗、化疗或其他已知的治疗方法有利于适当的补救行动，需要快速且简单的用于癌症的早期诊断的方法。同样重要的是用于癌症的好诊断方法的可用性以评估患者对治疗的反应，或评估由于在原来位置的再生或转移的复发。目前已知几种类型的癌症标记物，例如，癌基因产物、生长因子和生长因子受体、血管生长因子、蛋白酶、粘附因子和肿瘤抑制基因产物等，它们不仅被认为对于早期诊断是必要的，而且对于不明确的临床异常情况的患者的区别诊断也是必要的，例如区分恶性和良性异常情况；预测已确定恶性的具体患者对选择的治疗方法的治疗可能的反应；以及提供与人或动物受试者中恶性的风险、存在、状态，或未来的行为有关的信息。目前，通过检测肿瘤或癌症标记物来检测和诊断癌症的能力是广泛关注的领域，并因此存在对在患者标本中鉴定新的和更有用的肿瘤标记物的可重复的和可靠的方法的需求。胶质母细胞瘤是最常见的和最恶劣的人类原发性脑肿瘤类型。部分地由于阻碍了治疗药物的传递和潜在的重要的诊断标记物的检测的血脑屏障，该疾病很难诊断并且治疗甚至更难。胶质母细胞瘤的诊断标记物是可获得的，但只针对肿瘤组织本身并且需要肿瘤样品。为在早期阶段检测癌症并跟进疾病的进展，需要改进的筛选和检测方法。在癌症的情况下，我们的状态下，我们不仅需要检测肿瘤，而且还需要在它已达到不可返回的点之前检测它，此时治疗成为姑息治疗而非治愈性治疗。高危人群以及具有复发性癌症的患者，应广泛进行监控。此外，因为肿瘤对不同的治疗方法能有不同的反应，病人分层变得非常重要。使用肿瘤活检的遗传分析已经允许对癌症的诊断和新兴的病人分层策略有用的许多突变的鉴定。然而，当前肿瘤的遗传分析的缺点是需要肿瘤活检，这往往不可能解剖患者。此外，使用的活检是静态的，并且不允许遗传监测随时间推移的肿瘤恶化或复发。而且，许多肿瘤是异质的，从而导致这类肿瘤活检的潜在的假阳性或假阴性的遗传特性。最近，将循环肿瘤细胞用于肿瘤进展或复发的诊断和监测表明将血液用作肿瘤来源的材料源，特别是细胞形式的组织碎片。然而，循环肿瘤细胞的使用对于大多数癌症是无效的。一般情况下，疾病标记物定义为，与正常健康受试者比较时，患病患者的生物流体中浓度改变，优选浓度升高的化合物，并且其随后可用作表明疾病的标记物化合物。然而，在多种体液中作为疾病例如癌症的标记物的具体化合物例如蛋白质的鉴定，已经由缺乏其合适的技术而受到阻碍。另外，在癌症以外的疾病的情况下，标记物可以利用但难以检测。这阻碍疾病的早期诊断。本专利技术旨在克服现有技术的问题:并非所有患病组织或疾病类型(例如肿瘤)都产生循环患病细胞(例如循环肿瘤细胞)。本专利技术还旨在克服用于检测疾病例如癌症的蛋白质标记物难以检测的问题。另外，本专利技术旨在提供不需要活检并允许广泛监测患者的方法。
技术实现思路
本专利技术的第一方面提供一种分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法。所述方法包括下述步骤:a)从所述血样的无核血细胞,优选凝血细胞(thrombocyte)中提取核酸，以提供无核血细胞提取的核酸片段(fraction)，以及b)分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在，其中，所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因中的疾病特异突变，或其中所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因的疾病特异表达谱(expression profile)。本文使用的术语“无核血细胞”指没有细胞核的细胞。该术语包括对红细胞和凝血细胞的引用。在本专利技术各方面中无核细胞的优选实施方式是凝血细胞。术语“无核血细胞”优选不包括对作为错误的细胞分裂的结果而没有细胞核的细胞的引用。本文使用的术语“有核细胞”指具有细胞核的细胞。该术语包括对体细胞、生殖细胞和干细胞的引用，并且可包括来自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝、肾、脾、胸腺、甲状腺、神经组织、结缔组织、血液、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤组织的细胞。有核细胞优选来自病变组织的细胞。因此，本专利技术一般旨在分析从有细胞核的细胞已转移到没有细胞核的细胞中的核酸，其中，所述没有细胞核的细胞能容易地从血液流中分离并包含来自有核细胞的核酸。术语“细胞核”指在真核细胞中发现的膜封闭的细胞器，其包含大部分以染色体形式组织的细胞的遗传物质。这些染色体内的基因是细胞的核基因组。细胞核的内部包含一些亚核体(subnuclear body),该亚核体包括主要参与含RNA的核糖体的组装的含RNA的核糖体。在细胞核内产生后，核糖体输出至它们翻译mRNA的细胞质。无核血细胞提取的核酸片段优选是指包括染色体DNA、核糖体RNA、细胞核RNA和/或信使RNA的片段。本文所用的术语“基因”，并且特别是表述为“有核细胞的基因中的突变”的术语意思是指有核细胞(体细胞)的染色体和染色体外的任何核酸序列，优选细胞核核酸序列，并且可包括转录序列和非转录序列以及核糖体RNA序列，最优选转录成RNA的染色体序列。在本专利技术方法的优选实施方式中，所述疾病特异突变发生在染色体基因内。在另一优选实施方式中，所述基因不是来自无核血细胞的基因。在本专利技术方法的优选实施方式中，所述疾病特异表达谱是染色体基因表达谱。具体地来自有核细胞的染色体基因，它的mRNA存在于凝血细胞中。在本专利技术方法的另一优选实施方式中，所述核酸是核糖核酸(RNA)，更优选是信使核糖核酸(mRNA)。在本专利技术方法的优选实施方式中，所述核酸不是mtDNA。因此，线粒体核酸优选不是本专利技术的方面。在根据本专利技术分析血样的方法的另一优选实施方式中，分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在的所述步骤b)包括选择性扩增:i)所述突变，使用至少一种核酸突变特异扩增引物或探针，通过反转录酶聚合酶链反应扩增，或ii)多个mRNA，通过反转录酶聚合酶链反应扩增，以确定编码所述mRNA的染色体基因的表达水平，由此以提供所述基因的表达谱，并将所述表达谱与参考谱进行比较。优选血样在体外。在本专利技术方法的优选实施方式中，所述疾病选自由癌症、自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病组成的组。在本专利技术方法的另一优选实施方式中，所述疾病选自由自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病组成的组。在本专利技术方法的另一优选实施方式中，所述疾病是癌症。在本专利技术方法的又一优选实施方式中，所述癌症是优选选自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝、肾、脾、胸腺、甲状腺、神经组织、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤的实体肿瘤癌症。在本专利技术各方面的优选实施方式中，自体免疫性疾病选自由下述疾病组成的组:胃酸缺乏自身免疫性主动慢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.16 EP 10169897.5;2011.03.18 EP 11158912.3;1.一种分析受试者血样中疾病标记物的存在的方法，所述方法包括下述步骤: a)从所述血样的无核血细胞，优选凝血细胞中提取核酸，以提供无核血细胞提取的核酸片段；以及 b)分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在； 其中，所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因中的疾病特异突变；或 其中，所述疾病标记物是所述受试者的有核细胞的基因的疾病特异表达谱。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无核血细胞是凝血细胞或红细胞，优选凝血细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、皮肤疾病、眼疾病、内分泌疾病、神经紊乱以及心血管疾病组成的组。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述疾病是癌症，优选其中所述癌症是优选选自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝、肾、脾、胸腺、甲状腺、神经组织、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤的实体肿瘤癌症。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述疾病特异突变发生在染色体基因内，或其中，所述疾病特异表达谱是染色体基因的表达谱。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述核酸是核糖核酸(RNA)，优选mRNAo7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，分析所述无核血细胞提取的核酸片段中疾病标记物的存在的所述步骤b)包括选择性扩增: i)所述突变，使用至少一种核酸突变特异扩增引物或探针，通过反转录酶聚合酶链反应扩增，或 ii)多个mRNA，通过反转录酶聚合酶链反应扩增，以确定编码所述mRNA的染色体基因的表达水平，由此以提供所述基因的表达谱，并将所述表达谱与参考谱进行比较。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法是诊断受试者所述疾病方法的一部分，并且其中，所述无核血细胞提取的核酸片段中所述疾病标记物的存在表明所述受试者患有所述疾病。9.一种用于确定受试者的疾病阶段或疾病治疗的疗效的方法，包括下述步骤: 使用根据权利要求1 8中任一项所述的方法在第一时间点分析受试者血样中疾病标记物的存在，由此提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的第一值； 使用根据权利要求1 8中任一项所述的方法在第二时间点分析所述受试者血样中疾病标记物的存在，由此提供所述受试者中所述疾病标记物的含量的第二值，其中，所述受试者已经在所述第一时间点和所述第二时间点之间接...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·武丁格尔，罗尔夫·乔纳斯·尼尔松，
申请(专利权)人：阿姆斯特丹自由大学及阿姆斯特丹自由大学医疗中心基金会，
类型：
国别省市：