本发明专利技术公开一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHR1、编码该蛋白的基因及应用，属于基因工程技术领域，是为了解决采用分子育种方法改善作物磷利用率低的问题。一种玉米低磷胁迫反应调控因子ZmPHR1，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了编码上述调控因子ZmPHR1的基因，所述基因的序列含有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；以及上述基因在植物育种中的应用。本发明专利技术的基因及其编码蛋白在作物中，特别是玉米、小麦和水稻等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl、编码该蛋白的基因及应用。
技术介绍
土壤中磷素的缺乏是一个世界性的问题，在30-40%的可耕地中磷的浓度仅有I 10PM，这么低的磷含量不能满足植物生长和发育的需要。通常人们通过施用磷肥来保证植物正常的生长和获得较高的作物产量，然而，即使有充足的磷肥供应，大部分磷肥也会与碱性土壤中的钙离子或酸性土壤中的铝离子和铁离子形成不可溶的化合物，或者与微生物作 用形成有机物质，仅有20%左右的磷素被植物吸收利用；此外，土壤中的部分无机磷通过雨水冲洗或径流进入地下水中，导致土体富营养化，而且这种情况越来越成为一个全球化的环境问题。加之，长年过多的施用无机磷肥对不可再生的磷矿资源也是一种消耗和浪费，最终导致提高了作物的产量成本。为了解决作物磷利用率低的问题，有必要对缺磷条件下的磷利用调控机制进行认识和了解，从而采用分子育种方法改善作物的这一性状。在缺磷条件下，植物已经形成了一系列的适应机制。已有报道，在拟南芥中有29%的转录因子与磷饥饿反应有关。转录因子诸如WRKY75、ZAT6、MYB62、BHLH32、AtPHRl和PHR1-LIKE1是不同植物中调控磷素动态平衡的主要调控子。其中，属于MYB-CC家族一员的AtPHRl是拟南芥中第一个在转录水平上被证明对磷饥饿起调控作用的转录因子它以二聚体的形式与一系列磷饥饿响应基因启动子区域的一段不完全回文序列(P1BS，GNATATNC)结合，从而调控相应基因的表达(Rubio et al. 2001; Franco-ZorriIIaet al. 2007;Nilsson et al. 2007)。将AtPHRl进行转基因研究，结果表明，在转化后的野生型株系和突变体株系中无机磷的含量均得到了显著提高(Bari et al. 2006; Nilsson et al.2007)，说明AtPHRl在提高磷的利用方面起到作用。近年来，从水稻中分离出的0sPHR2与AtPHRl有些类似，过量表达0sPHR2的株系中，几个磷转运蛋白基因的表达均得到了上调，认为与茎中磷含量的提高呈正相关，从而推测0sPHR2在提高水稻磷利用效率方面也起到调节作用(Zhou et al. 2008)。玉米是世界上最重要的栽培作物和经济作物，大部分都生长于酸性和碱性土壤，由于磷肥很容易被土壤颗粒所吸附，导致形成不可溶性的磷化合物，影响到玉米正常生长及获得较高产量。有研究表明，玉米不同的种质材料对磷的利用效率存在基因型差异，通过温室和田间试验的磷利用效率筛选研究，只有极少部分自交系被认为属磷高效利用基因型。而磷的高效利用属于数量性状，受多基因控制，转录因子的导入，将能调控下游一系列磷利用相关功能基因的表达，对提高作物磷利用效率是一种切实可行的方法(Century etal. 2008)。然而，到目前为止，在玉米中，尚未有与PHRl相似的转录因子的报道。本专利技术通过对玉米转录因子ZmPHRl的分离、序列分析和异源功能验证等研究证明，在拟南芥中过量表达ZmPHRl，调控了一系列磷诱导基因和磷转运蛋白基因的表达，从而使植株对磷胁迫的敏感性得到了缓解，改善和提高了低磷条件下植株的长势和茎叶中磷的含量，从而为育种工作者通过遗传工程手段提高磷利用效率提供了物质基础。
技术实现思路
为了采用分子育种方法改善作物磷利用率低的问题，本专利技术提供了一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl、编码该蛋白的基因及应用。本专利技术是采用如下技术手段实现的 一种玉米低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸 所形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供了编码上述调控因子ZmPHRl的基因，所述基因的序列含有SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了含有上述基因的植物表达载体。所述的植物表达载体，包括 (1)植物表达载体为pJIT163-ZmPHRl:: GFP，及其在构建过程中生成的各种中间载体，是将所述基因插入PJIT163 GFP的Sal I和BamH I酶切位点之间得到的； (2)植物表达载体为pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP，及其在构建过程中生成的各种中间载体，是将限制性内切酶KpnI和Xho I双酶切重组质粒甲得到的小片段和限制性内切酶KpnI和SalI双酶切pCAMBIA1300得到的大片段连接得到的。本专利技术还提供了一种农杆菌菌株，是将含有植物表达载体pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株GV3101获得的。本专利技术还提供了过量表达的转基因纯合株系，是通过将含有植物表达载体pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的农杆菌菌液点滴法导入拟南芥中获得的。本专利技术扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对，所述引物序列如下 引物对I 正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'； 反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'。引物对2 正向引物5' -CACCCTTTATTTCTCAGTCATCCAA -3' 反向引物5' -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG -3' 本专利技术还进一步提供了上述基因在植物育种中的应用。在低磷条件下，转ZmPHRl基因株系的含磷量极显著高于野生型植株，ZmPHRl过表达后增加了转基因植株对磷的吸收，从而可改善植株的磷营养状况，使得植株的株高，生物量与野生型植株相比均得到明显增加，根冠比与野生型植株相比均得到明显减小，如图5所示。由于过表达ZmPHRl可增加植物的吸磷能力，因而在同样的土壤肥力的条件下，特别是低磷条件下，ZmPHRl转基因植株可以少施肥，减少土壤环境污染，节约资源。本专利技术的基因及其编码蛋白在作物中，特别是玉米、小麦和水稻等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。附图说明图1 pJIT163-ZmPHRl GFP 的结构示意 图 2 pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP 的结构示意 图3转基因拟南芥纯合株系； 图4转基因株系PCR检测结果； 图5转基因株系RT-PCR检测结果； 图6转基因拟南芥植株GFP荧光显示结果； 图7转基因拟南芥植株根系中GFP荧光显示结果； 图8过量表达株系的获得； 图9 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系在高磷(ImM Pi)和低磷(IOyM Pi)条件下的生长情况； 图10 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)条件下植株根系和地上部的磷含量； 图11 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)条件下憐响应基因的表达； 图12 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)条件下磷转运蛋白基因的表达。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，材料，如无特殊说明，均为常规方法和自常规生化试剂商店购买得到的，其中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHR1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述的低磷胁迫因子ZmPHRl的基因。3.权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的序列含有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。4.一种扩增权利要求2、或3所述基因的全长或其任意片段的引物对，所述引物序列如下引物对I正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'；引物对2正向引物5' -CACCCTTTATTTCTCAGTCATCCAA -3'反向引物5' -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG -3'。5.含有权利要求2、或3所述基因的植物表达载体。6.权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述载体为PJIT163-ZmPHRl :: G...
【专利技术属性】
技术研发人员：白建荣，王秀红，刘惠民，孙毅，史向远，任志强，
申请(专利权)人：山西省农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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