微阵列制造技术

公开了使用三维或结构微阵列制备二维微阵列的方法。本发明专利技术涉及通过惰性材料在三维微阵列的表面结构上成层来形成限定的功能化区域。然后除去足量的所述惰性材料和足量的表面结构顶部以现出所述惰性材料内表面结构的限定区域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用的二维和三维微阵列的开发。具体地，本专利技术一般涉及样品中的化合物或靶分析物的检测，特别是但不仅是测定样品中是否存在含特定碱基序列的核酸，定量样品中特定核酸碱基序列的数量，测定具体基因的启动子区域内甲基化的存在和/或程度，和多种因素对核酸甲基化的影响，这些因素包括环境、饮食或药物。
技术介绍
多种行业对于检测和鉴定各种靶分析物，包括但不限于分子或蛋白质(包括抗体)的快速、精确且低成本方法的需求日益增长。具体地，对于能(若需要时)由非技术人员无需标准实验环境来进行的测试的需求有所增长。尽管传感器技术是快速扩展的
，仍有多种问题妨碍现场测试和精确检测超越某些灵敏度限度。这些问题包括读取仪器和/或传感方法的复杂特性，意味着往往需要可观的培训和专门技能；低灵敏度传感技术 要求在检测可行前的靶分析物浓缩；需要容纳于实验室中的传感仪器的大尺寸以及相应的非便携特性；对于微生物而言靶物种生长至可测浓度所需的时间；能够发生所研究的反应或结合的表面区域和相应的低表面区域可用性；往往难以进行测量；以及最终对可供所得任意测定参照的参比标准的要求。核酸(NA)检测和碱基对测定，以及基因启动子区域的甲基化存在或程度的测定都会受益于改进的传感器技术。NA检测和碱基对测定通常需要利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), —种用于将少许拷贝核酸用酶促复制扩增几个数量级的方法。用于分析样品的后续方法取决于样品中的核酸量和该分析所需的细节。因此，这些方法复杂性各异，从简单的电泳凝胶到更复杂的质谱技术，前者给出样品与样品的比较，后者给出下至原子水平的细节。DNA甲基化是在CpG双核苷酸(DNA中胞嘧啶核苷酸与鸟嘌呤核苷酸通过磷酸二酯键连接的区域)中胞嘧啶的5-碳上共价加成甲基基团。所述共价加成反应由DNA甲基转移酶催化。DNA甲基化通过改变基因表达而不改换DNA序列来影响细胞功能。在细胞分裂过程中，所述改变也可以是可遗传的。基因的转录要求RNA聚合酶(执行复制过程的酶)与启动子(或表观遗传)区域的连接。基因的启动子区域含有特定的DNA序列和效应元件。启动子区域可含有多簇CpG二核苷酸，其可称作CpG岛或区域。若一个或多个CpG 二核苷酸中的胞嘧啶碱基被甲基化，该启动子区域不再可用，防止所述基因的转录。因此甲基化的启动子区域不能使用，而未甲基化的启动子区域则可以。因此发现DNA甲基化在生物体的发育和正常功能以及疾病的发展中都起到重要作用，也因而成为深入研究的对象。将DNA与各种条件(例如，疾病、表型等)关联的很多研究着重于DNA甲基化在DNA链的启动子区域中的作用。这是因为已显示表观遗传改变常见于癌症，且通常涉及DNA的甲基化过度和甲基化不足。甲基化过度指CpG区域的甲基化程度增高。其进而导致可遗传的转录沉默，且当肿瘤抑制物基因被沉默时，可导致癌细胞。肿瘤抑制物基因提供编码用于抗增殖信号和负责抑制有丝分裂与细胞生长的蛋白质。相比之下，甲基化不足是指基因组其它区域的甲基化降低。甲基化不足通常发生在正常情况下高度甲基化的重复性DNA中，由于原本被沉默基因表达的活化而导致转录增强和突变率提高。已发现癌症中的DNA甲基化改变，特别是CpG区域的甲基化过度，发生在癌症发展的相对早期。因此，DNA甲基化可用作检测疾病如癌症的重要生物标记物。此外，由于甲基化后基因序列保存不变，通过甲基化而沉默的个体基因保持完整，因此能通过DNA甲基转移酶的小分子抑制剂来重新活化。近期研究已表明，启动子区域的甲基化会受多种因素影响，包括饮食和环境因素。通常用质谱来测定甲基化的存在并定量DNA甲基化的变化，但这涉及多个预备步骤(例如，DNA的复制)且昂贵又耗时。 专利技术目的本专利技术的目的是提供二维和三维微阵列用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用。本专利技术的进一步或另一目标是提供测定特定分子或化合物是否存在于样品中和/或以任何方式被修饰的方法。本专利技术的进一步或另一目标是提供用于测定样品中是否存在包含特定碱基序列的核酸的方法。本专利技术的进一步或另一目标是使得含特定碱基序列的核酸的检测无需用PCR预浓缩。本专利技术的进一步或另一目标是提供通过对样品内含特定核酸碱基序列的核酸计数来定量的有用方法。本专利技术的进一步或另一目标是提供方法来测定基因的启动子区域中甲基化的存在和/或程度，和/或多种因素如环境、饮食或药物对核酸甲基化的影响。本专利技术的进一步或另一目标是至少为公众提供一种有用选择。
技术实现思路
本专利技术的第一方面提供用于测定感兴趣靶化合物在样品中的存在的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包括多个限定的功能化区域的微阵列，所述限定的功能化区域是连接有感应剂的限定区域，所述感应剂能连接样品中的感兴趣祀化合物；b)将所述微阵列与至少部分样品接触；以及c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。所述微阵列上的多个限定的功能化区域优选是在多个表面结构上的限定区域，其上连接有能对样品内的感兴趣靶化合物给出可检测传感器响应的感应剂。能提供可检测响应的信号个体优选连接样品中的待检测靶化合物以形成混配样品，且所述限定的功能化区域中的感应剂给出的传感器响应通过所述信号个体与感应剂的连接来提供。所述信号个体优选能提供可检测信号或响应的化学、生物或物理个体。所述信号个体优选颗粒，且选自有色微珠、突光微珠、磁性微珠或挡光微珠。所述颗粒优选聚合物微珠，包括但不限于聚苯乙烯珠、PMMA珠和PET珠。 所述可检测传感器响应优选选自颜色、荧光、磁性或挡光。所述可检测传感器响应优选能通过数码计数、重量测定、荧光、光学和/或电学手段来读取。所述可检测传感器响应优选产生定量/定性、荧光、光学或颜色度量测定中的任意一种或其组合。所述可检测传感器响应优选包括视觉响应、分光光度响应、荧光技术、电势或静电响应、磁性光折射、热、频率和数码响应。所述可检测信号响应优选是数码的。所述可检测信号响应优选产生定量或定性的测定。 所述样品优选是生物样品，包括但不限于组织样品、流体样品，或口腔擦拭物。在一种优选实施方式中，所述样品是包含核酸的生物样品。在另一实施方式中，所述样品是包含微生物，多肽或蛋白和/或抗体的生物样品。本专利技术的第二方面提供用于测定感兴趣靶化合物在样品中的存在的方法，所述方法包括以下步骤a)提供在基材上包括多个表面结构的微阵列，所述表面结构在表面结构顶部的限定功能化区域顶部连接有感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣祀化合物；b)将至少部分样品通过所述阵列；以及c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。能提供可检测响应的信号个体优选连接样品中的待检测靶化合物以形成混配样品，且所述限定的功能化区域中的感应剂所给出的传感器响应通过所述信号个体与感应剂的连接来提供。所述信号个体所连接的化合物优选是核酸单链的合成的互补拷贝。所述信号个体优选能提供可检测信号或响应的化学、生物或物理个体。所述信号个体优选颗粒，且选自有色微珠、突光微珠、磁性微珠或挡光微珠。所述颗粒优选聚合物微珠，包括但不限于聚苯乙烯珠、PMMA珠和PET珠。所述可检测传感器响应优选选自颜色、荧光、磁性或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.15 AU 2010901595;2010.05.31 AU 20109023651.用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供包括多个限定的功能化区域的微阵列，所述限定的功能化区域是连接有感应剂的限定区域，所述感应剂能连接样品中的感兴趣祀化合物； b)将所述微阵列与至少部分样品接触；以及 c)通过检测所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应来测定感兴趣靶化合物的存在。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述微阵列上的多个限定功能化区域是多个表面结构顶部的限定区域。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述靶化合物选自微生物，肽或蛋白质，和/或抗体。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述感应剂和靶化合物一起是生物识别基团或结合剂。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述感应剂和靶化合物一起是选自抗体/抗原，DNA/DNA, DNA/蛋白质，蛋白质/蛋白质，蛋白质/受体，细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对的生物结合或识别基团。6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品、流体样品或口腔擦拭物。7.用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供在基材上包括多个表面结构的微阵列，在所述表面结构顶部的限定的功能化区域上所述表面结构连接有感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣祀化合物； b)将至少部分样品通过所述阵列；以及 c)通过检测所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应来测定感兴趣靶化合物的存在。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述感应剂和靶化合物一起是生物识别基团或结合剂。9.如权利要求7或8所述的方法,其特征在于，所述感应剂和IE化合物一起是选自抗体/抗原，DNA/DNA, DNA/蛋白质，蛋白质/蛋白质，蛋白质/受体，细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对的生物结合或识别基团。10.如权利要求2-9中任一项所述的方法，其特征在于，各表面结构的顶部包括限定的功能化区域。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述微阵列包括多个不同的感应剂。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，各限定的功能化区域包括多个感应剂。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶化合物上连接有能提供可检测响应的信号个体。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述信号个体在步骤(b)之前连接于所述样品中的靶化合物，或者所述信号个体在步骤(b)和(C)之间连接于所述靶化合物。15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述信号个体是能提供可检测信号或响应的化学、生物或物理个体。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述信号个体是颗粒且选自带色微珠、荧光微珠、磁性微珠或光阻挡微珠。17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述信号个体是聚合物微珠。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述聚合物微珠选自聚苯乙烯珠、PMMA珠和PET珠。19.如权利要求13-15中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述信号个体包括核酸单链的合成的互补拷贝。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于所述可检测响应选自颜色、荧光、光阻挡、视觉响应、分光光度响应、电势或静电响应、磁性光折射、热、频率和数码响应。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述可检测响应能通过数码计数，重量测定，突光、光学和/或电学手段来读取。22.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测响应产生定量/定性、荧光、光学或比色测定中的任何一种或组合。23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述限定的功能区域的直径在约Inm到1000 μ m之间。24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述限定的功能区域与所述信号个体或所述靶化合物相比大小相同或更小。25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述限定的功能区域彼此间隔的间距为约5nm到约20 μ m。26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述微阵列上每平方厘米有约250，000到10亿个限定的功能区域。27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述微阵列由塑料材料、金属、陶瓷、氧化物、硅或光致抗蚀剂形成。28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述塑料材料选自PMMA、PET和PS;而所述金属是铝。29.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其特征在于，用于测定目的在所述微阵列的底面上连接或形成有纹理层使光在其穿透微阵列处沿表面分散。30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述微阵列由蚀刻、平版印刷法、热压印、纳米压印和注射成型或者通过连续成型技术形成。31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述限定区域采用NH2或COOH官能团来功能化。32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，在所述NH2或COOH官能团上连接有接头基团。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述接头基团是共价接头基团。34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述感应剂连接于所述接头基团。35.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述感应剂连接于所述NH2或COOH官能团上。36.如权利要求32-34所述的方法，其特征在于，所述接头基团选自脂族化合物，PEG分子和聚合物，蛋白质或DNA链。37.如权利要求1-29所述的方法，其特征在于，所述感应剂通过接头基团直接连接于所述表面结构的顶端。38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述微阵列在限定的功能化区域之间涂覆有惰性材料。39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述惰性材料选自金或银或铬，聚合物或油。40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述惰性材料是选自金、银或铬的任意两种金属的组合。41.如权利要求38-40所述的方法，其特征在于，所述惰性材料包括硫醇、蛋白质和/或PEG材料层以确保涂层粘附。42.如权利要求38-41所述的方法，其特征在于，所述微阵列包括二级惰性涂层。43.如权利要求7-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是生物样品。44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述生物样品是组织样品、流体样品或口腔擦拭物。45.如权利要求7-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶化合物是核酸。46.如权利要求7-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶化合物是生物样品，包括微生物，肽或蛋白质和/或抗体。47.一种用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的三维微阵列，所述微阵列包括 a)包括多个表面结构的基材； b)所述多个表面结构包括感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣祀化合物，所述感应剂包括在各表面结构顶部上限定的功能化区域上。48.如权利要求47所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构是毫米到纳米大小的表面结构。49.如权利要求47或48所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构随机排列在微阵列的表面上或者所述表面结构基本一致且彼此均匀隔开。50.如权利要求47-49中任一项所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构采用锥形或脊状形式。51.如权利要求47-50中任一项所述的三维微阵列，其特征在于，所述限定的功能区域的直径在约lnm-1000 μ m。52.如权利要求51所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构上限定的功能化区域直径在约I μ m-约20 μ m。53.如权利要求52所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构上限定的功能化区域直径在约5 μ m-约15 μ m。54.如权利要求47-53中任一项所述的三维微阵列，其特征在于，所述限定的功能化区域与所述靶化合物相比大小相同或更小。55.如权利要求47-54中任一项所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构上的限定的功能化区域彼此间隔的间距为约5nm-约20 μ m。56.如权利要求55所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构上的限定的功能化区域彼此间隔的间距为约I-约2...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·海恩斯，A·C·帕特里奇，Y·吴，
申请(专利权)人：数码传感有限公司，
类型：
国别省市：