一种生物农药和昆虫防治方法技术

本发明专利技术提供了一种昆虫防治方法，该方法为将针对鳞翅目昆虫特定基因的siRNA与阳离子聚合物配伍喂食鳞翅目昆虫，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、聚赖氨酸和明胶。本发明专利技术还涉及了一种生物农药，该农药以针对鳞翅目昆虫特定基因的siRNA为有效成。本发明专利技术涉及通过饲喂含有昆虫特异基因如：干扰昆虫线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因、乙酰胆碱酯酶基因、γ-氨基丁酸受体基因等的siRNA对鳞翅目昆虫的基因表达进行抑制，从而干扰昆虫正常的生长发育，进而实现对昆虫的有效治理；进一步通过盆栽实验结果，显示这是一类高效的生物杀虫剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学合成及修饰的小分子干扰RNA领域，具体地，是涉及。
技术介绍
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象，它是进化上高度保守且在生物界普遍存在的一种基因调控机制。1998年在线虫Caenorhabditis elegans中首次发现了这种现象，随后在真菌、植物、昆虫和动物中也发现了这种现象。RNAi的作用机制是体外导入的或内源性转录生成的长链dsRNA 被 Dicer 家族 RNase-III 切割成 21_25nt(喊基)的 siRNA, siRNA 进一步与 Argonaute蛋白结合形成RISC(RNA-induced silencing complex),最后由RISC介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合引起同源靶mRNA分子的特异性降解。近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。以特异性副除或关闭昆虫特定基因的表达为基本思路，探索害虫防治的新策略，有望成了新型生物农药创制的热门技术。线虫在摄入或局部注射dsRNA后，其RNAi效应能传遍整个有机体甚至是传递到后代，此被定义为系统性RNAi。昆虫必须具有体内传播RNAi效应的机制，才能有望实现以siRNA为主效因子的生物农药防治策略。昆虫系统性RNAi效应首次在赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中发现，此虫幼虫期注射Tc-ASH基因的dsRNA,在成虫期表现出缺失鬃的显型(Tomoyasu Y, Denell RE. Larval RNAi in Tribolium(Coleoptera)for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 2004, 214:575-578),并且此昆虫Distalless等基因的RNAi效应会从亲代传递至子代(Bucher G. Parental RNAi inTribolium(Coleoptera)-Curr Biol, 2002，12:R85_R86)。目前，系统性 RNAi 效应已存在如下昆虫中得已验证双翅目昆虫采采蝇；鞘翅目昆虫赤拟谷盗；膜翅目昆虫蜜蜂；直翅目昆虫蝗虫；蜚蠊目昆虫德国小蠊；鳞翅目昆虫斜纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾、浅棕苹果蛾；半翅目昆虫豌豆蚜。系统性RNAi效应在昆虫中的广泛性，表明siRNA在害虫防治方面具有广泛的应用潜力。鳞翅目(L印idoptera)昆虫纲中第二大目。完全变态。幼虫一般称为毛虫，亦称“蛄撕”。蛹为被蛹。成虫称蛾或蝶，其翅和体上密被鳞片，故名。具吸收口器，形成长形而能卷起的喙；复眼大；触角变化多，呈丝状、羽状或栉状等。全世界已知有十四万种左右，我国已有记载的约两万种。大多数种类与国民经济有重大关系，如螟虫、粘虫、松毛虫和菜粉蝶、小菜蛾等，为农林植物的重要害虫；家蚕、柞蚕和蓖麻蚕等，是著名的资源昆虫。据最近几年的相关报道，昆虫通过饲喂表达dsRNA的植物或菌株，能有效的阻断昆虫目标基因的表达。毛颖波等(2007)通过转基因手段，让植物自身产生P450基因的dsRNA。然后,将植物喂食棉铃虫(Helicoverpa armigera)。dsRNA从食道进入细胞,抑制棉铃虫体内P450基因的表达，致使棉铃虫 对棉子酚的抗性降低。最后，对棉铃虫造成致命的影响。玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera Leconte)饲喂含有 V-ATPaseA等基因的dsRNA植物饲料，幼虫出现滞育或死亡，显著降低了此虫对玉米根部的危害。田宏刚等(2009)利用具有双17启动子的载体L4440和RNase III缺失的HT115(DE3)菌株，构建了诱导表达能产生seCHSA基因dsRNA的工程菌株，饲喂甜菜夜蛾，导致个别虫体出现畸形或死亡。RNA干扰技术已应用于小菜蛾功能基因的研究。如Z.-X. Yang等用微注射的方法导入cadherin基因的dsRNA，导致该虫的死亡率和性别比率增加，并且幼虫期出现滞育现象。通过饲喂的方法，导入小菜蛾细胞色素P450 (CYP6BG1)基因的dsRNA，致使该虫对除虫菊脂类农药的抗性降低(Ma, A. M. B. , Tadashi, M. , Ken M. , Toshiharu, T.RNAinterference-mediated knockdown of a cytochrome P450,CYP6BG1, from thediamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin.Insect. 2009. Biochem. Mol. Biol. 39:38 - 46.)。据此，我们认为小菜蛾具有系统性RNA干扰的能力，有可能实现以RNA干扰技术为手段的防治策略。虽然目前的研究开启了 RNAi技术在害虫防治方面应用的新一页，但其中基因特异dsRNA仅来自于转基因植物或是工程菌株，抑或是体外转录生成。目前制约利用RNAi技术生产新型生物农药的重大共性和关键技术是一、现有利用转基因技术转入作物体系防治害虫的技术体系和策略存在转基因植物食品安全性问题；二、表达dsRNA的工程菌株见效慢、防效低，且环境适应性难以评估；三、dsRNA的体外转录合成成本高、稳定性不好等。这些问题极大的限制了该技术在害虫防治领域的广泛应用。
技术实现思路
为克服以上的缺点，本专利技术提供一种新的昆虫防治方法。具体技术方案如下一种昆虫防治方法，主要包括将针对鳞翅目昆虫特定靶标基因的SiRNA喂食鳞翅目昆虫，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，所述靶标基因为Y -氨基丁酸受体基因、或为Y-氨基丁酸受体基因和乙酰胆碱酯酶基因和、或为Y-氨基丁酸受体基因和线粒体复合物III Fe-S亚基基因、或为Y -氨基丁酸受体基因和线粒体复合物III Fe-S亚基基因以及乙酰胆碱酯酶基因。更优选地，将上述siRNA直接喷雾在鳞翅目昆虫食用的农作物的叶片上，让昆虫自然取食。本专利技术所述的昆虫防治方法，通过体外化学合成17-50nt双链RNA (siRNA)的方法，还可通过化学修饰以及与阳离子聚合物配伍增强了 siRNA的稳定性和药效，通过自然饲喂或喷雾含有特定靶标基因siRNA的饲料来有效的阻断昆虫靶基因mRNA的表达，对昆虫造成致命影响。该方法制备以siRNA为主效因子的生物农药，具有周期短、见效快、无毒、无环境污染等优点，可以广泛地使用。本专利技术的另一目的是提供一种生物农药。一种生物农药，以针对鳞翅目昆虫特定靶标基因的siRNA为有效成份，所述siRNA为体外化学合成17_50nt的双链RNA。优选地，所述生物农药还包括有阳离子聚合物为有效成份，更优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或明胶。优选地，所述siRNA经化学修饰或siRNA3’末端还设有以两个脱氧核苷的组合的悬挂碱基，所述化学修饰为2’ -甲基化，氟代，5’ -PEG，胆固醇，或多肽等。优选地，所述siR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物农药，其特征是，以针对鳞翅目昆虫靶标基因的siRNA为有效成份，所述siRNA为体外化学合成17？50nt的双链RNA，所述靶标基因为γ？氨基丁酸受体基因、或为γ？氨基丁酸受体基因和乙酰胆碱酯酶基因和、或为γ？氨基丁酸受体基因和线粒体复合物ⅢFe？S亚基基因、或为γ？氨基丁酸受体基因和线粒体复合物ⅢFe？S亚基基因以及乙酰胆碱酯酶基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，龚亮，胡美英，
申请(专利权)人：广州市锐博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：