本发明专利技术公开了注射用重组卵泡抑素制剂配方和制备工艺，每支制剂含：a)1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；b)1％-5％甘露醇；c)0.2％-1％甘氨酸。本发明专利技术还公开了上述制剂的制备方法及该制剂的用途。本发明专利技术具有表达量高，活性高，纯化工艺简单等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及卵泡抑素，尤其涉及一种注射用重组卵泡抑素制剂及其制备方法。
技术介绍
卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽，对卵泡刺激素有较强的抑制作用。卵泡抑素分布较为广泛，在不同组织中均能检测到卵泡抑素。目前发现卵泡抑素至少有32KD，35KD,39KD三种不同的分子形式。卵泡抑素(Follistatin)作为Activin的结合蛋白，它可以通过Activin/Follistatin系统来调节动物的生殖活动。近年来的实验表明，卵泡抑素可以通过其作用系 统，参与机体多种生理机能的调节，对卵巢颗粒细胞分化、胚胎发育、红细胞生成和成骨细胞功能的调节均起重要的作用，具有重要的生物学意义。卵泡抑素(Follistatin)可用于治疗肌肉疾病和病症，尤其是肌肉组织的增加将有利于治疗的疾病，也可用于治疗与代谢、脂肪组织及骨变性相关的疾病和病症。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种表达量高、活性高、纯化工艺简单的重组卵泡抑素制备工艺；以及一种不含保护剂和防腐剂、有效期长的注射用重组卵泡抑素制剂配方。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的一种注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。根据上述的制剂，优选的，所述制剂以每支计算包含I. 0-5. Omg重组卵泡抑素的冻干粉；1% _5%重量百分比的甘露醇；O. 2%-1%重量百分比的甘氨酸。根据上述的制剂，优选的，所述制剂以每支计算包含2mg±0. 2mg重组卵泡抑素的冻干粉；1%重量百分比的甘露醇；O. 2%重量百分比的甘氨酸。本专利技术的目的还通过以下技术方案实现的上述的制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤(Al)建立菌种库取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，并在恒温箱培养，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，振荡若干时间，取菌液和等量灭菌甘油混匀，分装并保存；传代若干次后，菌种应重新激活培养保存；(A2)种子液培养；从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，培养若干时间，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至0D600为O. 4-0. 8之间；(A3)发酵培养；在发酵培养基中培养，并以一定速度补料，当0D600为7-12时，加入IPTG诱导剂，继续发酵培养若干时间后，终止培养；(A4)收集和破碎菌体；收集菌体诱导完的菌液用离心机离心；破碎菌体将离心后菌体用缓冲液悬浮均匀，使用细胞破碎机进行碎菌，再用离心机离心，收集上清液，即粗制重细卵泡抑素蛋白溶液； (A5)目的蛋白纯化将所述上清液通过亲和层析柱，用包含不同浓度咪唑的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白粗制品；再通过阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白精制品；(A6)浓缩半成品通过过滤系统去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1-5 %甘露醇和O.2-1 %甘氨酸，混合均匀后过滤，即制成重组卵泡抑素半成品；(A7)冷冻干燥将所述重组卵泡抑素半成品稀释，分装于西林瓶中，在冷冻干燥机上进行冻干处理若干时间，最后进行压盖、封口处理。根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(Al)进一步包括如下步骤(BI)菌种进行以下鉴定，鉴定合格后投入生产形态特征观察将所述菌种划线于kan抗性的LB平板，并培养，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长；表达量检测挑取单克隆菌，接种于l_3ml含kan的LB液体培养基，30_45°C摇床振荡1-5小时，检测0D600为O. 4-0. 6时，加入IPTG诱导，继续振荡3_4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量；质粒检查抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(Al)进一步包括以下步骤从_70°C冰箱取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，37°C恒温箱培养16小时，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，37°C摇床振荡12小时，取菌液和等量30%灭菌甘油混匀，使甘油终浓度为15%。用灭菌后的1.5ml EP管分装数管，保存于-70°C冰箱。传代3次后，菌种应重新激活培养保存。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A2)进一步包括以下步骤从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，在37°C培养16小时，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至0D600为O. 4-0. 8之间，即可用来接种发酵培养使用。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A3)中，发酵培养基配方为酵母提取物(Yeast)5g/L蛋白胨(Typtone)10g/L氯化钠(NaCl)10g/L补料培养基配方为酵母提取物(Yeast)50g/L蛋白胨(Typtone)100g/L甘油(glycerole)50g/L ；发酵条件37°C培养，以200ml/小时速度补料，当0D600为7-12时，加入IPTG诱导剂，浓度为O. 5mM，继续发酵培养4小时后，终止培养。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A4)中，诱导完的菌液用大容量冷冻高速离心机，5000rpm/min，4°C离心10分钟，收集菌体；破碎菌体将离心后菌体，用lxPBS、pH7. 4缓冲液悬浮均匀，冰浴条件下使用超声波细胞破碎机进行碎菌，20分钟后，用大容量冷冻高速离心机，10000rpm/min，4°C离心10分钟，收集上清即为粗制重组卵泡抑素蛋白溶液。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A5)中，重组蛋白粗纯化将粗制的重组蛋白通过镍离子亲和层析柱，用包含不同浓咪唑的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白粗制品；重组蛋白精细纯化将重组蛋白粗制品通过Q-Sepharose阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白精制品。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A6)中，超滤浓缩半成品将重组蛋白精制品通过Millipore超滤系统,去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1%甘露醇和O. 2%甘氨酸，混合均匀后用O. 22um过滤器过滤，即制成重组卵泡抑素半成品。根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A7)中，分装，冷冻干燥将重组卵泡抑素半成品稀释成合适的浓度，分装于3ml西林瓶中，每瓶Iml液体，随后在冷冻干燥机上进行冻干处理，整个升温过程不超过30°C，24小时后冻干结束，进行压盖，封口处理。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果I、得到的重组卵泡抑素纯度> 95%,每一剂量所含重组卵泡抑素为2mg左右，是因为临床最佳用量是50ug/kg ；2、得到的重组卵泡抑素比活性高，实验结果表明，比活性大于7000IU/mg ；3、生产工艺简单，产物收率高，生产成本低。附图说明参照附图，本专利技术的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是这些附图仅仅用于举例说明本专利技术的技术方案，而并非意在对本专利技术的保护范围构成限制。图中图I本专利技术实施例I的制备方法的流程图。具体实施例方式图I和以下说明描述了本专利技术的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本专利技术。为了教导本专利技术技术方案，已简化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含：重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨威威，雷振松，刘莹，朱振洪，陈展志，
申请(专利权)人：杭州康邦生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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