癌症基因治疗中的噬菌体和原噬菌体蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种对动物细胞具有增殖抑制活性或细胞死亡诱导活性的多肽的用途。本发明专利技术进一步提供使用所述多肽的手段和方法和含有所述多肽的编码区的相应核酸序列。本发明专利技术进一步涉及表达所述多肽的载体，用于治疗增生性病症或疾病如癌症的药物组合物和治疗方法。最后但并非最不重要的，本发明专利技术提供一种使用所述对动物细胞具有增殖抑制活性或细胞死亡诱导活性的多肽的基因治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种对动物细胞具有增殖抑制活性或细胞死亡诱导活性的多肽的用途。本专利技术进一步提供使用所述多肽的手段和方法和含有所述多肽的编码区的相应的核酸序列。本专利技术进一步涉及表达所述多肽的载体，用于治疗增生性病症或疾病如癌症的药物组合物和治疗方法。最后但并非最不重要的，本专利技术提供一种使用所述对动物细胞具有增殖抑制活性或细胞死亡诱导活性的多肽的基因治疗方法。
技术介绍
作为死亡原因的癌症的发展在具有良好卫生保健的人群中和高百分比的老年人中是一个日益严重的问题。迄今为止，治疗癌症或者治愈患者只有有限的选择，如手术或化疗和放疗。这是为什么基因治疗方法已经演变为主要集中于治疗癌症的一个原因。一种基因治疗方法使用所谓的自杀基因。自杀基因是这样一种基因，其在细胞中的表达对于该细胞是致死性的。大多数自杀基因通过编码病毒、细菌、真菌、植物或人类的将具有低毒性的化学物质转化为细胞毒性化合物的酶来介导细胞杀伤效应。该方法也被称为基因介导的酶前药治疗(GDEPT)，或者如果使用病毒载体输送该基因，则被称为病毒介导的酶前药治疗(VDEPT)。这种前药转化或条件毒性自杀基因编码的大多数酶通过破坏DNA复制来介导毒性，而自杀基因表达的产物诱导前药转化为其毒性代谢物，然后该代谢物作用于复制的DNA。研究最多的一些酶是单纯疱疹病毒(HSV)-1胸苷激酶、来自细菌或酵母的胞嘧碇脱氨酶、细菌硝基还原酶和哺乳动物肝脏酶细胞色素P450。一旦这些酶在靶细胞中表达，就能够全身应用相应的前药(分别为更昔洛韦、氟胞嘧啶、CB1954和环磷酰胺或异环磷酰胺)，并且前药将只在携带和表达相应自杀基因的细胞中被活化。在另一种方法中，植物酶基因linamarase(1is)将生氰葡糖苷底物亚麻苦苷(1in)水解为葡萄糖和细胞毒性氰化物。这些方法的缺点是全身施用前药，这意味着高剂量，可能会引起副作用，特别是对于细胞色素P450，它在肝细胞中优势性地生理表达。另一个缺点是癌细胞抗性的发展，这种抗性的发展或者是针对前药或者是针对细胞杀伤的，在这种治疗中细胞杀伤通常是由于细胞凋亡，因此是由于携带相应自杀基因的细胞的消耗而引起的。另一个策略是利用编码对细胞具有直接致死效应的细胞毒性蛋白质如促融膜蛋白如水泡性口膜炎病毒(VSV)糖蛋白或长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的基因。促融膜蛋白一旦在靶细胞中表达，就会引起相邻细胞的膜融合，导致形成大的多核合胞体，最后死于凋亡或坏死。曾经用于直接细胞杀伤的其他毒素有例如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)毒素A、霍乱毒素B、炭疽(炭疽杆菌(Bacillus anthracis))毒素、假单胞菌(绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))毒素或篦麻毒素(蓖麻(Ricinuscommunis))。另一种方法利用所谓的凋亡诱导剂来激活凋亡途径并且诱导细胞死亡。在这些研究中使用的基因是，例如，胱天蛋白酶-1/白介素-1β-转化酶(ICE)、胱天蛋白酶-3/CPP32β、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-8、具有死亡域的Fas相关蛋白(FADD)和Bax。自杀基因必须以确保它们被尽可能多的靶细胞摄取和表达，而同时限制它们被非靶细胞表达的方式被导入细胞中。对于癌症的自杀基因治疗理想地需要能够区分靶细胞和非靶细胞的载体。对于病毒载体(综述见)，当编码毒性基因来保护相应的包装细胞不被过早杀死时，需要严格控制的生产系统。虽然已经知道一些细胞毒性自杀基因，但是仍然需要具有有利特征，特别是能够杀死或清除患者中的靶细胞特别是癌细胞的另外的和替代的自杀基因。因此本专利技术的一个目的是提供新的一组细胞毒性自杀基因和它们相应的在真核细胞特别是动物或哺乳动物细胞包括人细胞中具有细胞生长抑制和/或细胞死亡诱导活性的细胞毒性蛋白质或多肽。专利技术详述我们兹证明，噬菌体和原噬菌体来源的α-螺旋型通道形成蛋白，特别是穴蛋白(holin)，其天然通过在细胞质膜中形成孔而引起原核细胞裂解，当被导入和/或在真核细胞特别是动物或人细胞中表达时，引起明显的细胞生长抑制或者甚至细胞死亡诱导活性。在本专利技术的上下文中，术语“动物”或“动物细胞”是指属于动物界的生物体或生物体的细胞，其分类是根据当前的包括动物界、植物界、原生生物界、真菌界和原核生物(包括原核细菌和蓝细菌)界的五界分类系统(Margulis和Schwartz，1998.Five Kingdoms.An illustratedGuide to the Phyla of Life on Earth.，W.H.Freeman，New York)。因此，术语“动物细胞”也包括“人”细胞。但是，为了强调，在本申请的几个部分中另外也提到人细胞。在本专利技术下文中，“动物或人细胞”可以位于组织内或动物或人的体内(“体内”)，或者可以从其天然环境如细胞系、原代细胞中分离出来(“体外”)。术语特征在于细胞异常增殖的“增生性疾病”或“增生性病症”在本文中广义使用，包括需要控制细胞周期的所有疾病，例如癌症和白血病，以及心血管疾病，如再狭窄和心肌病，自身免疫病，如肾小球肾炎和类风湿性关节炎，皮肤病，如牛皮癣，抗炎、抗真菌、抗寄生虫病，如疟疾、肺气肿和脱发。在这些疾病中，噬菌体来源的蛋白质，优选本专利技术的穴蛋白，能够用来在靶细胞群体内诱导细胞死亡或保持停滞。噬菌体来源的“穴蛋白”属于一个由至少16个表现出共同结构和功能特征的不同蛋白质家族组成的功能性超家族。更具体而言，噬菌体编码的穴蛋白是α-螺旋型通道形成蛋白的成员，并且是裂解被感染细菌细胞所需要的，因此是释放噬菌体颗粒所需要的。然而，该家族的成员未表现出统计学显著的序列相似性或同源性。在本专利技术的上下文中，术语“噬菌体”包括噬菌体本身以及原噬菌体，原噬菌体是处于休眠状态或者甚至缺陷的噬菌体。其基因组或者被整合到宿主细菌的基因组内或者自主复制。穴蛋白由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的原噬菌体以及与这些生物体有关的噬菌体的基因编码。穴蛋白的主要功能似乎是将胞壁质水解酶跨过细胞质膜转运至细胞壁，这些酶在细胞壁水解肽聚糖细胞壁聚合体中的键，作为细胞裂解的前奏。当由染色体编码时，这些酶是自溶素。穴蛋白也可以促进电解质和营养物从细胞质中流出，从而加速细胞死亡。胞壁质水解酶缺乏N-末端信号序列，因此被认为不能通过普通的分泌途径转运。穴蛋白肯定形成寡聚复合体，在细胞质膜中形成孔。这些孔被认为给它们的底物蛋白质提供了被动转运途径。本专利技术人非常惊奇地发现，当这些穴蛋白在人或动物细胞中表达时，在这些细胞中诱导细胞杀伤或者抑制细胞生长。这些结果特别令人惊讶，因为真核细胞代谢完全不同于细菌系统的代谢。另外，真核细胞的结构和组织也根本不同于细菌细胞，而且真核细胞不是噬菌体的宿主。因此，无法预测穴蛋白是否能在动物细胞或人细胞中表达，它们将使用哪些途径，相应地这些蛋白质将位于细胞区室中的何处，它们的功能是被保持还是被改变，细胞代谢是受到影响还是被激活，最后但并非最不重要的，这些穴蛋白向真核细胞中的导入和在其中的表达将有何种效果。在回答这些和其他基本研究问题时，专利技术人得以提供使用噬菌体来源的穴蛋白治疗增生性疾病和癌症的手段和方法。特别是，他们提供了用于治疗癌症的基因治疗途径的手段和方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的噬菌体来源的蛋白质作为治疗增生性疾病或病症的药物的用途，其中所述噬菌体来源的蛋白质在真核细胞中诱导细胞生长抑制活性或细胞杀伤效应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌多布拉西，克里斯蒂娜霍埃纳德尔，
申请(专利权)人：奥斯彻诺伐生物技术公司，
类型：发明
国别省市：AT[奥地利]