western印迹分析技术制造技术

本发明专利技术涉及western印迹分析技术。根据本发明专利技术的实施例，本发明专利技术提供了进行western印迹分析的方法，所述方法包括依次执行下述步骤：a)预染色样品中的蛋白质；b)使用凝胶电泳分离蛋白质；c)分析分离的蛋白质以确定总蛋白质含量和/或至少一个持家蛋白质含量；d)将蛋白质转移到至少一个膜上；e)探测分离的蛋白质以检测靶蛋白质；f)分析探测的蛋白质以确定靶蛋白质的分子量和/或靶蛋白质的含量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】western印迹分析技术本申请要求提交于2010年5月21日的GB1008517.3和提交于2011年1月5日的GB1100092.4的提交日期优先权，它们的公开内容以引用方式并入本文。
本专利申请涉及进行western印迹分析(blotanalytical)技术的改良的方法。
技术介绍
Western印迹法是劳动密集型实验室分析方法，其广泛地应用于生命科学中以确定在复杂样品中是否存在靶蛋白质并且以确定靶蛋白质的相对量。所使用的术语“靶蛋白质”是指分析方法的使用者期望在复杂样品内辨识的蛋白质。使用蛋白质的相对数量来测量蛋白质表达中的变化(即.上调和下调)。通过结合下述两个变量来实现确定是否存在特定蛋白质：蛋白质的分子量及其免疫特性(假定蛋白质的这两个极为不同的方面不可能偶然共存)。通过下述方式来实现确定特定蛋白质的相对数量：将复杂样品中的靶蛋白质与总蛋白质元素或常见的“持家(housekeeping)”蛋白质的数量比较。所用术语“持家”蛋白质是指涉及细胞基本功能的常见蛋白质，例如，肌动蛋白或微管蛋白。在western印迹分析中量化总蛋白质或“持家”蛋白质的第二功能是它们可被用作为加载对照。可使用总蛋白质或“持家”蛋白质存在的数量来辨识通道(lane)加载中和样品制备中的不准确性。然后，使用这些差异来归一化靶蛋白质数值，从而把这些不准确性考虑进去。标准western印迹方法使用电泳(如，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)分离复杂样品中的蛋白质，然后，将分离的蛋白质电转移到固体膜(通常，由硝化纤维或聚偏二氟乙烯制成，PVDF)使得蛋白质保持同样的分离模式。然后，将此膜在稀释的蛋白质溶液(如，脱脂奶粉或牛血清白蛋白(BSA))中培育，以阻断非特异性键合部位，然后使用一级抗体(即，特别用于靶蛋白质)培育，使用允许用于靶蛋白质检测的二级抗体洗和培育。这称作免疫检测。一旦用户已经确定所述样品中是否存在靶蛋白质，就将第一和第二抗体就从所述膜剥离，并且所述膜使用替代第一抗体(特别用于可用作为加载对照的另一个蛋白质)来培育，使用允许用于加载对照的检测的第二抗体来洗和培育。通常，整个方法完成需5至8小时，尽管一些使用者喜欢将整个方法中的一些步骤过夜运行。关于标准western印迹方法的问题包括下述事实：通常，电泳之后分离的蛋白质样品不可见，因此使用者不能容易地分析蛋白质分离的结果。可在分离之后将分离的蛋白质样品染色以使得使用者可完全可见分离的蛋白质,然而，这种方法工作强度大并且耗时。一种用于蛋白质后分离(postseparation)但在免疫检测之前的检测的常用方法是将分离介质暴露于PonceauS染色剂。此方法需要在致使蛋白质可见之前劳动密集型的染色和脱色步骤。使用此技术显示的蛋白质通常是不明显的和缺乏捕获数字图像所需的对照。另外，免疫检测的当前方法通常使用化学发光和照相胶片，来自PoceauS染色的总蛋白质的图像将不直接与靶蛋白质的图像比较。通常所用的另一种方法是使用两个恒定的电泳蛋白质分离物来比较蛋白质总量与靶蛋白质的总量。将一种分离介质染色以用于总蛋白质的检测而另一种介质被转移到用于靶蛋白质的免疫检测的固体膜。此方法在多种情况下(特别是贵重样品或仅小体积样品)不具吸引力。另外，正象多数人那样将样品加载到电泳设备，在不同电泳分离物之间人工比较蛋白质元素，由于不正确加载样品导致结果的不正确判读。这表明，确定蛋白质表达所需要的附加处理步骤导致以试剂和时间的形式的附加成本。此外，如果使用标准western印迹方法，使用者不能容易地比较在免疫检测前和后从同一分离的蛋白质样品得到的结果。关于标准western印迹方法的另一个问题是其包括多个步骤，所述多个步骤涉及若干不同设备，从而妨碍形成一体化，所述多个步骤还包括单独的设备，需要用它来对已经被探测到之后的最终样品成像。另外，这些多个步骤的多数包括湿化学，所述湿化学可导致重现性降低。例如，最广泛地使用检测靶蛋白质的方法为通过化学发光，并包括将照相胶片暴露于western印迹。为了定位与印迹接触的照相胶片，使用照相胶片需要将印迹转移到暗室，通常是远离实验室的一些地方。通常，需要显影暴露的胶片的照相胶片处理部件是昂贵的并且难于维护保养。使用照相胶片的另一个问题是获得适用于定量分析的靶蛋白质的不饱和图像需要耗时的反复试验并会出错。总的来说，标准western印迹方法为劳动密集型的、耗时的并且使用大量试剂。
技术实现思路
从而，需要非常迅速的和高效的western印迹分析技术。本专利技术的实施例提供了进行western印迹分析技术的改良的方法，所述改良的方法通过提供快速的、高效的和方便的替代形式克服了多个上述问题。根据本专利技术的实施例的第一个方面，本专利技术提供了进行western印迹分析技术的方法，其中，所述方法包括依次执行下述步骤：a).预染色样品中的蛋白质；b).使用凝胶电泳分离蛋白质；c).分析所分离的蛋白质以确定总蛋白质含量和/或至少一个持家蛋白质含量；d).将蛋白质转移到至少一个膜上；e).探测分离的蛋白质以检测靶蛋白质；并且f).分析所探测的蛋白质以确定靶蛋白质的分子量和/或靶蛋白质的含量。在另一个实施例中，提供了一种设备，其被配置用于执行具有上述特征的方法。本专利技术已经开发出克服了至少部分下述缺点的系统：进行标准western印迹的科学家通过观察来比较实验内的样品和其它实验的样品，例如，比较靶蛋白质表达的浓度。通常，由眼睛来完成，以确定靶蛋白质是否比另一个更明亮。此方法在加载和初始样品制备中很容易出现错误。更严格地讲，并且通常需要公开的结果，需要比较靶蛋白质和加载对照蛋白质的亮度。为了进行比较，膜需要进行剥离和重新探查以加载对照蛋白质，这会增加实验的时间并且进一步增加实验的复杂性。与此种传统的方法相比，本专利技术的示例性实施例具有样品中的所有蛋白质被预染色(步骤a)这样的优点。这使得该设备能够在电泳(步骤b和c)之后测量总蛋白质含量或加载对照蛋白质的量。一旦已经将蛋白质转移到膜并且执行western印迹(步骤d和e)，膜就可使用相同措施重新分析以确定相对于总含量或加载对照(在步骤c中测量)的靶蛋白质的分子量和/或含量(步骤f)。本专利技术的方法具有显著的优点，即其不需要膜的剥离和重新探测以测量加载对照并且由于以相同的措施使用校准特征图像来进行分析，可直接比较电泳后和western印迹后的校准特征图像。通过使用本专利技术的这种实施例，科学家还可分析转移后的膜并且使用转移的结果作为质量控制步骤以确保良好的转移并作为加载对照。在标准的方法中，科学家将必然使用转移后的PonceauS染色作为QC测试并且随后在探测前脱色。由于PonceauS成像困难并且western印迹之后成像的不同方法，PonceauS图像不易于与western印迹之后的图像比较。实施例的另外的优点为其不需要运行具体的western印迹分子量标准。由于电泳之后的原始图像与western印迹膜的校准，来自电泳的分子量标准提供了用于分子量的校准。本专利技术的实施例的方法允许使用者在探测分离的蛋白质中投入时间和精力之前检查是否已经成功地完成步骤b)和d)。另外，使用分离的蛋白质的分析结果来确定总蛋白质否定了在步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.21 GB 1008517.3;2011.01.05 GB 1100092.41.一种进行Western印迹分析技术的方法，其中，所述方法按以下顺序执行：a).预染色样品中的蛋白质；b).使用凝胶电泳分离所述蛋白质；c).分析所分离的蛋白质以确定总蛋白质含量和/或至少一个持家蛋白质含量；d).将所述蛋白质转移到至少一个膜上；e).探测所分离的蛋白质以检测靶蛋白质；以及f).分析所探测的蛋白质以确定所述靶蛋白质的含量或者分子量和含量，其中，将所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量与所述靶蛋白质含量比较，以获得总蛋白质和/或持家蛋白质含量相对靶蛋白质含量的比率。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质含量被计算为相对于电泳凝胶中的荧光的位置而绘制或相对于从蛋白质分离开始的固定点处检测到所述荧光的时间而绘制的荧光强度曲线下方的面积。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述总蛋白质含量被确定为相对于电泳凝胶中的荧光的位置而绘制或相对于从蛋白质分离开始的固定点处检测到所述荧光的时间绘制的荧光强度曲线下方的全部面积。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶蛋白质含量和/或持家蛋白质含量被确定为在相对于电泳凝胶中的荧光的位置而绘制或相对于从蛋白质分离开始的固定点处检测到所述荧光的时间而绘制的荧光强度曲线上的特定峰值下的面积。5.根据权利要求1所述的方法，其中，靶蛋白质的浓度是用下述方式计算的：使用已知蛋白质浓度的含量来建立校准曲线，并将所述靶蛋白质含量绘图到所述校准曲线上。6.根据权利要求1所述的方法，其中，执行所述靶蛋白质的系列稀释以提高确定靶蛋白质浓度的计算的精确度。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量用作含量对照。8.根据权利要求7所述的方法，其中，将所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量用作含量对照，并使用这些数值来归一化所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量相对于靶蛋白质含量的比率。9.根据权利要求1所述的方法，其中，使用至少一个荧光基团将所述样品中的所述蛋白质预染色。10.根据权利要求9所述的方法，其中，使用多于一个荧光基团，各荧光基团在不同波长处激发和发射，使得在分析期间可单独地识别各荧光基团。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述总蛋白质和/或持家蛋白质与荧光基团相关，所述靶蛋白质与下述荧光基团相关：该荧光基团相对于与所述总蛋白质和/或持家蛋白质相关的荧光基团而言在不同波长处激发和发射。12.根据权利要求1所述的方法，其中，分析所分离的蛋白质以确定总蛋白质含量的步骤包括：捕获所分离的蛋白质的图像。13.根据权利要求1所述的方法，其中，分析所探测的蛋白质以确定靶蛋白质含量的步骤包括：捕获所探测的蛋白质的图像。14.根据权利要求1所述的方法，其中，分析所分离的蛋白质以确定所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量和/或分析所探测的蛋白质以确定所述靶蛋白质含量的步骤包括：使用软件分析技术来处理分析数据。15.根据权利要求1所述的方法，其中，分析所分离的蛋白质以确定所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量以及分析所探测的蛋白质以确定所述靶蛋白质含量的步骤是在单个分析设备上执行的。16.根据权利要求1所述的方法，其中，使用可编程的计算机来控制在凝胶电泳期间使用的电压和时间。17.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤b)期间添加通道标记物，来帮助绘制所分离的蛋白质的分析结果和所探测的蛋白质的分析结果。18.根据权利要求1所述的方法，其中，使用分子量定径标记物来帮助绘制所分离的蛋白质的分析结果和所探测的蛋白质的分析结果。19.根据权利要求1所述的方法，其中，分析所分离的蛋白质以确定所述总蛋白质含量和/或持家蛋白质含量和/或分析所探测的蛋白质以确定所述靶蛋白质含量的步骤包括：通过参考存储的信息来辨识所述样品。20.根据权利要求1所述的方法，其中，使用可编程计算机来控制在将所分离的蛋白质转移到至少一个膜上的过程中使用的电压和时间。21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：捕获所述电泳凝胶后转移的图像，作为蛋白质转移的效率的质量控制步骤。22.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：肯尼思·G·马克拿玛瑞，斯图尔特·保尔沃特，
申请(专利权)人：LAB九零一有限公司，
类型：
国别省市：