一种提高植物发酵沼气产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物发酵沼气产量的方法。属生物技术领域。首先克隆白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因，枯草芽孢杆菌的漆酶基因和木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β葡萄糖苷酶基因；构建含以上六种基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，将其质粒转化枯草芽孢杆菌获得工程菌；将枯草芽孢杆菌工程菌应用于植物原料发酵沼气的预处理过程以及与天然的沼气发酵微生物联合应用于发酵植物原料生产沼气过程，起到显著提高植物原料的利用率和增加沼气产量的作用。本发明专利技术解决了植物发酵沼气中遗留的木质素和纤维素不能有效地被水解利用的问题，有利于利用植物发酵沼气的产业的发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌和应用工程菌提高植物发酵沼气产量的方法。具体是一种应用携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌对植物原料进行预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气的方法。
技术介绍
沼气是一些有机物质在一定的温度、湿度、酸度条件下，隔绝空气，经微生物发酵而产生的一种以甲烷为主的可燃混合气体，是一种有多种用途的可再生能源。它能够代替石化燃料而应用于动力和热的产生，也能作为车用燃气，还能替代天然气作为生产一些化学制剂的原料。通过厌氧发酵生产沼气是一条CO2零排放的生产途径。沼气发酵必须有微生物参与。沼气发酵微生物是一个统称,包括发酵性细菌、产氢产乙酸菌、耗氢产乙酸菌、食氢产甲烷菌、食乙酸产甲烷菌五大类群。植物物质(包括农林废弃物，能源作物和水生植物等)是生产沼气的主要原料来源，由于能够通过光合作用而再生，资源十分的丰富。然而，在沼气发酵中，植物的发酵时间较长，有效成分转化为沼气的效率较低，通常小于50%。植物的粗纤维约占植物总物质的70 80%。粗纤维主要包括纤维素、半纤维素和木质素物质，其中纤维素所占的比例最大。纤维素和半纤维素水解后生成能被沼气发酵微生物食物链中之下游微生物所能利用的糖。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是由苯基丙烷结构单元通过醚键、碳-碳键联结而成的高分子化合物。用物理、化学或生物的方法于发酵之前对植物材料进行预处理使木质素水解，但是其作用很难达到完全。植物发酵沼气的预处理是其生产过程的瓶颈问题之一，是研究的热点之一。当前，对植物原料的预处理的物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学处理法具有工艺简单、效率高等特点，但所需无机酸、碱浓度高，处理后的纤维素和半纤维素损失大(回收率仅约50% )。与化学法预处理和物理法预处理相比，生物法具有反应温和、能耗较小，设备简单，不会带来环境污染等诸多优点。复合菌种方法和白腐真菌方法是生物法预处理植物原料的主要研究方向。前者一般包括多株具有分解木质素的微生物及由霉菌、细菌和放线菌等多种微生物组成的辅助功能菌的联合应用。其优势在于能够在分泌木质素酶上互补，使形成完整的木质素酶系，并且在生长上相互依存。但是，由于这些微生物的种类不同，其生长条件(包括温度的需求、酸碱度的需求和营养的需求)不可能一致，难于实现高效的表达酶。后者是应用含木质素酶的白腐真菌进行预处理。这种方法的优势在于，白腐真菌有完整的木质素酶系，但是白腐真菌生长缓慢，需较长的预处理过程。木质素酶系由木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶组成。木质素酶系具有分解木质素的功能。纤维素酶系由葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶组成。纤维素在纤维素酶系的协同作用下水解成葡萄糖。近些年来，人们十分关注酶对于沼气发酵的作用。即在沼气生产的过程中(包括预处理和发酵过程)加入相关的酶。加酶的方法能够较好地提高沼气的产量，但是价格昂贵。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)营养要求低，繁殖迅速，是对环境无害的微生物，能分泌表达蛋白，并且兼性厌氧，对温度和酸碱环境的耐受范围较广。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决当前的植物原料发酵沼气的木质素和纤维素不能有效地被水解的问题，根据木质素酶系具有水解木质素的作用，纤维素酶系具有水解纤维素为葡萄糖的作用，通过分子生物学技术，构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架，猛过氧化物酶基因表达框、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架，葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌 工程菌，而提供一种应用枯草芽孢杆菌工程菌进行植物原料沼气发酵的预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气的方法。本专利技术所采用的技术方案是，其步骤是I构建含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。I. I应用反转录PCR技术克隆白腐真菌(White rot fungi)的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因；应用PCR技术克隆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的漆酶基因；应用反转录PCR技术克隆木霉(Trichoderma)的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和￠-葡萄糖苷酶基因。I. 2获得构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒所需的启动子、信号肽、转录终止子、抗性基因、大肠杆菌复制起点、革兰氏阳性杆菌复制起点、多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因和G418抗性基因。I. 3构建如附图的含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。(说明.表达框架的DNA序列组成启动子-信号肽-基因-转录终止子)2.构建枯草芽孢杆菌工程菌。2. I应用电转化方法将含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和^-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌转化子)。2. 2筛选高表达木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶、漆酶、葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和3-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌转化子作为枯草芽孢杆菌工程菌。3.将枯草芽孢杆菌工程菌应用于植物材料的沼气生产。3. I将枯草芽孢杆菌工程菌应用预处理植物材料。3. 2将枯草芽孢杆菌工程菌与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气。本专利技术的提高植物发酵沼气产量的方法的优点体现于针对植物原料生产沼气的木质素不能有效地被水解，纤维素不能有效地被利用，致使原材料利用率低，沼气生产效率低，从而制约应用植物原料生产沼气产业发展的关键问题，而构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草·芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌，赋予其工程菌表达完整的木质素酶系和纤维素酶系的能力，并将这一工程菌应用于植物原料发酵沼气的预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气，起到加强植物原料的木质素的水解和纤维素的糖化作用，提高原材料利用率，提高沼气产量的作用。附图说明附图.含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高植物发酵沼气产量的方法，其特征在于应用分子生物学技术克隆白腐真菌的木质素过氧化物酶基因、白腐真菌的猛过氧化物酶基因，枯草芽孢杆菌的漆酶基因，木霉的葡聚糖内切酶基因、木霉的葡聚糖外切酶基因和木霉的0葡萄糖苷酶基因；构建含木质素过氧化物酶基因表达框架，猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架，葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒(含有以上所述的6种酶基因表达框架、大肠杆菌复制起点、革兰氏阳性菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因和G418抗性基因)；将以上构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化枯草芽孢杆菌，筛选高表达木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶、漆酶、葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌转化子作为携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱联，屠发志，易国辉，符仙，张泽华，张添元，尹慧祥，罗进贤，杨穗珊，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：