本发明专利技术公开了一种云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白PybHLH基因的特异性片段ΔPybHLH及其原核表达载体，利用RT-PCR技术从云南红梨中克隆特异性片段ΔPybHLH，并构建其原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达，获得云南红梨ΔPybHLH纯化蛋白，云南红梨ΔPybHLH纯化蛋白应用在制备PybHLH特异性抗体中，该抗体可用于PybHLH蛋白表达检测及免疫沉淀和染色质免疫共沉淀中，该抗体特异性强，能够准确的检测PybHLH蛋白的亚细胞定位、高效的进行PybHLH蛋白的纯化、高效分离PybHLH蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白基因的特异性片段及其原核表达载体，和原核表达载体在制备APybHLH蛋白和特异性抗体中的应用。
技术介绍
红色果皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究较多，而对植物中的bHLH和WD40蛋白研究较少。在拟南芥中LDOX基因启动子直接包括EGL3和TT8在内的不同的MYB-BHLH-TTG1转录复合物的调控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突变体试验也表明了 egl3和tt8是拟南芥幼苗花青素累积的必要条件。在拟南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白与WD-repeat/bHLH/MYB 转录复合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB转录因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA调控的花青素的累积和毛状体的发生，而JA诱导的JAZ蛋白的降解能够解除这种抑制。在大丽花(DahI iavariabilis)中，bHLH 转录因子 DvIVS 通过调控 DvCHSl，DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的转录来参与其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH转录因子MYCAl可能通过调控ANR和UFGT基因的表达来调控其花青素的生物合成。在龙胆花(G.中，GtMYB3和GtbHLH参与花青素的生物合成。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl，PAPl、PAP2、CPC、TRY)组合，形成 MYB/bHLH/WD40 复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、误表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获_耗尽机制在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl，GL3，GLl和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。在云南红梨着色机理研究方面，本实验室研究了光照对云南红梨着色的影响、构建了光诱导果皮差异表达基因的SSH文库，进行了着色相关基因的分离和表达分析。前期研究结果表明云南红梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40调控的。在前人研究基础上，针对云南红梨栽培品种早白蜜、满天红、美人酥着色不稳定、在国内外尚未见有关云南红梨果皮红色着色机理方面研究报道。在云南红梨着色机理研究中，还没有人克隆转录、因子bHLH，研究中PybHLH蛋白无法进行特异性检测和分析。目前世界红梨极其稀少，世界市场缺口较大；此外，云南红梨外观和内在品质好，商品价值高，红梨将成为梨产业发展的新的增长点，红梨育种成为梨树育种的重要方向。但是，指导育种的红梨着色的科学理论匮乏，本专利技术的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。本专利技术选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨I号’ PybHLH转录因子基因特异性片段的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化和抗体制备的研究，制备的抗体可用于云南红梨PybHLH蛋白的纯化、定位检测、表达分析以及PybHLH所结合蛋白和DNA片段的高效分离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个基因的特异性片段仏该基因是云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白基因的特异性片段，具有如SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的蛋白质。 本专利技术另一目的是提供云南红梨基因的原核表达载体pET32a-z^j^K仏该载体含有基因，基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端和C端均带有6 XHis标签。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨花青素合成及毛状体发生发育调控蛋白特异性片段APybHLH蛋白中。本专利技术另一目的是将原核表达载体应用在制备PybHLH蛋白特异性抗体中，特异性抗体能应用在PybHLH蛋白亚细胞定位、组织表达检测、PybHLH蛋白纯化、免疫沉淀(IP)及染色质免疫共沉淀(ChIP)中。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案 云南红梨PybHLH基因、Λ PybHLH纯化蛋白，由下述方法制备而得 (I)根据苹果履/从基因(GenBank登录号为DQ266451. I)编码框，设计I对特异引吻\ PybHLH-F 办’ -GTCGACATGGCTCAGAATCATGAGAGGGTG-3，取 PybHLH-R ·)’ CTCGAGGCACTTACCAGCAATTTTCCAAAGC，在上下游引物的5'端分别加入fe7I和通ol酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点)。以云南红梨总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PybHLH-F 和 PybHLH-R 进行扩增； 全长片段的回收；基因的T/A克隆和测序； (4)/>从^7基因的生物信息学分析及GenBank登录号的获得； (5)APybHLH片段的克隆将云南红梨果皮中的PybHLH蛋白序列与苹果、矮牵牛、拟南芥和玉米等调控花青素生物合成的bHLH转录因子进行比对，根据比对结果和pET32a载体，设计了一对引物-APvbHLH-F: CCATGGATTGCTGTGAGAAATCTTCCTCTG 和 APybHLH-R CTCGAGACCTTGCAAATTTGGGAGCAAATC,在上下游引物的5'端分别加入AfcoI和沿ol酶切位点(下划线部分为酶切位点)。以质粒pMDlST-/^^^^为模板，使用APybHLH-F取APybHLH-R进行扩增；全长片段的回收、T/A克隆和测序；(7)构建原核表达载体使用AfcoI和沿ol对片段和pET32a进行双酶切，分别获得5'和3'末端带有分别带有AfcoI和通ol酶切位点的基因片段和pET32a载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16 h，获得原核表达载体^1 ,2a-APybHLH ； APybHLH的原核表达载体的构建和原核表达使用热刺激法将mUybHLH铸入大肠杆菌办(DE3)中，在IPTG诱导下摸本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.云南红梨基因，其特征在于:基因具有如SEQID NO. 5所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的蛋白质。2.权利要求I所述云南红梨基因的原核表达载体pET32a-z^j^K仏其特征在于该载体含有/！/基因，基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点R...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，张晓东，崔道雷，樊磊，陈丽梅，舒群，苏俊，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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