本发明专利技术公开了一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，其步骤为：①一级种子培养；②二级种子培养；③连续发酵；④制剂；要求每克酪酸菌制剂成品中酪酸菌活菌数不少于1.0×109个；本发明专利技术方法是采用多罐串联连续发酵的方式培养酪酸菌，即以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度放出培养液，从而使发酵罐内的发酵液体积维持恒定，使酪酸菌在稳定状态下生长，可有效延长分批培养中的对数期，提高酪酸菌芽孢体的转化率至95%以上，有效提高发酵产率；同时还可降低劳动强度，提高设备利用率，省时省力，降低总的生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵
，具体是ー种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法。(ニ)现有技术酪酸菌即丁酸梭菌(Clostridium butyrium )是归属于梭菌属的革兰阳性厌氧芽胞杆菌，存在于土壤、动物和人体的肠道中，同双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及粪链球菌一祥，是调节人体及动物体肠道微生态平衡的有益菌。酪酸菌最显著的生物特性是能与双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌共生，并促进其发育，特别是它能产生促进双歧杆菌发育的因子。与双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌不同的是，由于酪酸菌具有芽抱，因而对外界环境有较强的抵抗力，把它加热至90°C 10分钟、100°C 5分钟不会失活，在PH I. 0-5.O的环境中仍能存活，在PH 4. 0-9. 8的环境中能适合其发育生长，其固体活菌制剂在室温、干燥情况下保存具有良好的稳定性，保存2年以上，未见活菌显著減少。酪酸菌制剂是目前国内微生态领域开发的又一新产品。酪酸菌是ー种厌氧的芽胞杆菌，由于它具有芽胞，因而具有高活性、高稳定性，同时它又是对常用抗生素具有耐受性的肠道正常菌群，可纠正肠道内的菌群紊乱，调节肠道微生态平衡，是ー种集乳酸菌和芽胞杆菌优点于一身的活菌制剂，在临床和实际应用方面有其独到之处。随着酪酸菌新生物制品四类新药的研制成功，酪酸菌的ー些生物特性和药理作用，受到国内研究者的普遍关注。将酪酸菌的培养液分离、鉴别，发现它含有葡萄糖、麦芽糖等6种糖，丁酸、乳酸和醋酸等有机酸，蛋白质分解酶等经透析仍不会减弱效力的蛋白质。其中以低聚糖具有最強的双歧杆菌増殖促进作用，是促进双歧杆菌发育的因子。酪酸菌培养液中小分子的有机酸可抑制常见致病菌的生长、定植。国内的许多研究报告已证实酪酸菌对大肠埃希菌、沙门菌等常见肠道致病菌具有拮抗作用。酪酸菌及其制剂主要应用于以下几个方面 I、作为药物使用 能够治疗肠菌群紊乱、腹泻、肠炎，预防肠癌。另外酪酸菌也可作为肠炎、肝病、化放疗造成的免疫力下降、菌群失调的良好辅助治疗药物。2、作为兽药使用 酪酸菌可用以治疗动物肠道感染和肠功能异常。酪酸菌可增加动物肠内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量，可促进排便，可抑制肠道腐败产物氨和胺类的产生；可抑制霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、出血性大肠杆菌以及引起伪膜性肠炎的魏氏梭菌的繁殖。3、用作饲料添加剂 酪酸菌能单独作为饲料添加剂使用，也能与乳酸菌、芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复配使用，能增强该类产品的功效。在提高动物免疫力、抗病カ及降低猪的料肉比方面都有显著效果目前。酪酸菌微生态制剂的生产主要是利用其活的芽孢体，获得大量的酪酸菌芽孢体或活菌体并保持它们的活性是酪酸菌制剂生产的关键，芽孢数目越多越好。酪酸菌的生产方法都是采用分批液态深层发酵法培养酪酸菌菌体和芽孢，然后分离菌体及芽孢，并将其做成制剂。目前酪酸菌制剂比较流行的生产方法是采用各自取得的酪酸菌生产菌种，使用三级种子培养的方法，发酵培养酪酸菌活菌体，采用管式离心机分离菌体，采用冻干机冷冻干燥的方法制备酪酸菌活菌制剂。目前国内外有关酪酸菌的文献及专利很多，下述专利US5.292523(1994)、US4.892 731 (1990)、7P63_146825(1986)、JP6I-6625 (1984)、JP06-166825(1994)、JP05-227898(1993)、 CNl144873C、 CNl184308C CN 100523171 C、 CN1403567 A 、CN1463934A、CN1385402A、CN 101965910 A、CN 101032527 A 涉及丁酸梭菌 活菌剂的制备和用途，酪酸菌的培养方法均采用间歇式分批发酵法，都没有涉及采用连续发酵法来制备酪酸菌活菌制剂的方法。分批发酵的缺点是人力、物力、动カ消耗较大；生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；生产效率低，生产上常以体积生产率(以每小时每升发酵物中菌体数量或代谢产物的g数来表示)来计算效率,在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。(Ξ)
技术实现思路
本专利技术的目的就是要提供ー种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法；本专利技术方法采用连续发酵法，使总发酵周期缩短，降低了染菌机会，減少了发酵风险和设备损失，节约成本，同时菌体生长的稳定期较长，菌体数量大，芽孢转化率高，有效提高了发酵产率。本专利技术的ー种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，由下述步骤组成 ①ー级种子培养将配制好的酪酸菌ー级种子培养基，分别置于三角瓶A和三角瓶B中，于121°C下蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35°C ;再取酪酸菌试管斜面菌种，分别接种于上述已灭菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接种时间延迟10-14h;将三角瓶A和B于34-37°C厌氧培养12-16h ;即得一级种子A和一级种子B; ②ニ级种子培养将配制好的酪酸菌ニ级种子培养基分别置于种子罐A和种子罐B中，于121°C蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35°C ;再将步骤①培养好的一级种子A和ー级种子B，以5%-10%的接种量分别接种于种子罐A和种子罐B中，其中种子罐B比种子罐A接种时间延迟10-14h，以上种子在34-37°C厌氧培养12_16h，即得ニ级种子A和ニ级种子B;培养过程中间歇搅拌；上述各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验； ③连续发酵 a.将配制好的酪酸菌发酵培养基，补料培养基分别置于发酵罐A和发酵罐B及补料罐C、补料罐D中，于121°C蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35°C ； b.先将步骤②中培养得到的ニ级种子A以5%-10%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压O. 02MPa-0. 04MPa，在34-37°C厌氧培养20_26h，发酵过程中间歇搅拌； c.发酵罐A接种培养10-14h后，将步骤②中培养得到的ニ级种子B以5%-10%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压O. 02MPa-0. 04 MPa,在34_37°C厌氧培养10_12h，发酵过程中间歇搅拌； d.发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使发酵罐A装料系数达到80%为止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使发酵罐B装料系数达到80%为止；e.当发酵罐A发酵培养20-26h后，将发酵罐A中的培养液以O.084v/h的速度连续放料到离心机中离心，收集菌体；同时将发酵罐B中的培养液以O. 084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以O. 084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐B中，維持发酵罐B的体积，保持物料的平衡；补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养基以满足发酵罐B的体积要求，以形成补料罐C或D —发酵罐B —发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体；所述的V为发酵罐A的实际装料体积； f.从发酵罐A开始放料至放料完毕，維持时间为140-360h;最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，其特征在于由下述步骤组成 一级种子培养将配制好的酪酸菌一级种子培养基，分别置于三角瓶A和三角瓶B中，于121°C下蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35°C;再取酪酸菌试管斜面菌种，分别接种于上述已灭菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接种时间延迟10-14h;将三角瓶A和B于34_37°C厌氧培养12_16h ;即得一级种子A和一级种子B; 二级种子培养将配制好的酪酸菌二级种子培养基分别置于种子罐A和种子罐B中，于121°C蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35 V ;再将步骤①培养好的一级种子A和一级种子B，以5%-10%的接种量分别接种于种子罐A和种子罐B中，其中种子罐B比种子罐A接种时间延迟10-14h，以上种子在34-37°C厌氧培养12_16h，即得二级种子A和二级种子B;培养过程中间歇搅拌；上述各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验； 连续发酵 a.将配制好的酪酸菌发酵培养基，补料培养基分别置于发酵罐A和发酵罐B及补料罐C、补料罐D中，于121°C蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35°C ； b.先将步骤②中培养得到的二级种子A以5%-10%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压O. 02MPa-0. 04MPa，在34-37°C厌氧培养20_26h，发酵过程中间歇搅拌； c.发酵罐A接种培养10-14h后，将步骤②中培养得到的二级种子B以5%-10%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压O. 02MPa-0. 04 MPa,在34_37°C厌氧培养10_12h，发酵过程中间歇搅拌； d.发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使发酵罐A装料系数达到80%为止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使发酵罐B装料系数达到80%为止； e.当发酵罐A发酵培养20-26h后，将发酵罐A中的培养液以O.084v/h的速度连续放料到离心机中离心，收集菌体；同时将发酵罐B中的培养液以O. 084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以O. 084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐B的体积，保持物料的平衡；补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡军，蔡翔，丁立，陈从富，
申请(专利权)人：湖北绿雪生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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